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抗人FXYD3单克隆抗体的制备应用及蓖麻毒素细胞毒作用的实验研究
中文名称: 抗人FXYD3单克隆抗体的制备应用及蓖麻毒素细胞毒作用的实验研究
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论文编号: 3767438收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Preparation and Clinical Application of Monoclonal Antibody to Human FXYD3 and Celltoxicity Study of Ricin
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 普通外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: FXYD3 单克隆抗体 蓖麻毒素 胆管癌 实时荧光定量PCR 细胞毒作用 原发性肝癌
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论文简介:研究目的: 1.研制抗人FXYD3单克隆抗体并对其进行生物学鉴定; 2.探讨FXYD3在肝胆系统肿瘤中的组织学分布及与肿瘤组织的生物学行为关系,揭示FXYD3蛋白在肿瘤演变过程中与其可能存在的内在联系; 3.从蓖麻籽中提取蓖麻毒素并对其进行生化鉴定; 4.比较肝胆肿瘤细胞系对蓖麻毒素毒性作用的敏感性及该毒素对FXYD3表达水平的影响,为本系列后期研究蓖麻毒素与抗人FXYD3单克隆抗体相连的免疫毒素及其在体内作用的实验研究提供依据。 研究方法: 1.采用BioSunV1.0分析软件分析FXYD3抗原抗体结合特性的优势抗原表位,采用固相合成法合成多肽并与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,利用Kohler与Milstein于1975年创建的杂交瘤技术制备抗人FXYD3单克隆抗体,并对其进行特性分析:间接ELISA方法测定抗体的相对亲和常数,Western-Blot法检测抗体的特异性,通过免疫细胞化学检测FXYD3在胰腺癌BxPc-3细胞系中的表达,并观察FXYD3蛋白在细胞中的定位; 2.用制备好的FXYD3单克隆抗体检测肿瘤细胞系原发性肝癌HepG2、胆管细胞癌Hcccc-9810、胰腺癌BxPc-3及肿瘤组织中的表达。免疫组化和免疫细胞化学及Western-Blot法定性判断FXYD3蛋白是否表达,Real-time PCR法定量判断FXYD3蛋白的表达程度; 3.将传统的由Nicolson与Blaustein创建的提取方法稍加改进,从蓖麻种子中提取天然蓖麻毒素并利用Sepharose4B亲和层析法进行纯化,SDS-PAGE电泳进行鉴定; 4.以肿瘤细胞系原发性肝癌HepG2、胆管细胞癌Hcccc-9810、胰腺癌BxPc-3为研究对象,MTT比色法分析蓖麻毒素对不同肿瘤细胞的抑制作用,流式细胞分析法分析其对Hcccc-9810细胞周期的影响及蓖麻毒素与肿瘤细胞系共培养研究该毒素对FXYD3在不同细胞中表述的影响。 研究结果: 1.获得了4株稳定分泌抗人FXYD3的杂交瘤细胞株,其中76-02F1E8特异性最显著,效价可达1:105,亲和常数为3.11×108L/mol。所有分泌的抗体亚型均为IgG1型,轻链为k链; 2.原发性肝癌、胆管癌、胃癌、乳腺癌均有FXYD3蛋白的表达,且前两者与相应的癌旁组织相比,表达有统计学差异(P<0.05);胆管癌组织FXYD3的表达与肿瘤细胞的分化程度相关。胰腺癌BxPc-3、胆管细胞癌Hcccc-9810与原发性肝癌HepG2均阳性表达FXYD3,且表达程度依次降低。 3.从500g蓖麻籽中提取到10.25mg蓖麻毒素,浓度为1.3mg/ml;4.蓖麻毒素对肝癌细胞、胰腺癌细胞和胆管癌细胞的抑制作用在不同浓度下(1×10-11mol/L、1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L)无差异性,IC50分别为0.637×10-9mol/L、0.366×10-9mol/L和0.535×10-9mol/L;该毒素可使Hcccc-9810细胞周期停滞在G0/G1期从而促进细胞凋亡;不同浓度蓖麻毒素的作用下,BxPc-3和Hcccc-9810细胞表达FXYD3的水平均有不同程度的降低。 研究结论: 1.FXYD3蛋白可能与原发性肝癌、胆管癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌等肿瘤的发生发展有一定关系; 2.FXYD3的表达有可能成为胆管癌预后的一个重要辅助指标; 3.FXYD3分别与AFP、CA19-9联合检测有可能提高原发性肝癌和胆管癌的检出率; 4.HepG2、BxPc-3和Hcccc-9810对蓖麻毒素抑制作用均较为敏感且无选择性; 5.蓖麻毒素可导致FXYD3在肿瘤细胞中表达减少。
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