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烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究
中文名称: 烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究
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论文编号: 3767371收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Effect of High Mobility Group Box-1 Protein on Regulatory T Cells after Major Burns: Experimental and Clinical Studies
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 烧伤外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 高迁移率族蛋白B1 调节性T细胞 树突状细胞 T淋巴细胞 丙酮酸乙酯 烧伤 脓毒症
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论文简介:目的: 实验一:⒈采用严重烫伤延迟复苏动物模型,明确高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的变化及其与调节性T细胞(Treg)免疫功能的关系。⒉通过严重烫伤延迟复苏动物模型,阐明HMGB1对Treg分化成熟的受体作用机制。⒊探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对树突状细胞(DC)免疫功能的影响及调节作用。⒋探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对T淋巴细胞免疫功能的影响及调节途径。⒌观察丙酮酸乙酯(EP)对重度烫伤延迟复苏动物免疫功能及脏器损害的可能保护效应。 实验二:⒈对临床严重烧伤患者进行动态监测,明确严重烧伤后病人外周血HMGB1、Treg分化成熟以及T淋巴细胞免疫功能的变化规律,探讨HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫功能改变在患者烧伤后发生脓毒症及不良预后中所起的作用及临床意义。⒉探讨严重烧伤后HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫指标间的相互关系及可能的作用机制。 方法: 1.采用重度烫伤延迟复苏动物模型,即雄性清洁级Wistar大鼠,浸于沸水中造成30%体表面积Ⅲ度烫伤。伤后延迟6小时抗休克复苏,在伤后6小时从腹腔给予林格液(40 ml/kg)抗休克治疗,此外在烫伤后12、24、36、48小时分别给予4 ml/次林格液腹腔内注射。实验分组:136只大鼠随机分为5组,⒈正常对照组(n=8):麻醉后活杀;⒉假烫伤组(n=32);⒊烫伤组(n=32);⒋EP治疗组(n=32):EP加入林格液中随补液给药(EP为28 mM);⒌晚期糖基化终末产物受体(RAGE)抗体(1 mg/ml)治疗组(n=32):烫伤后6、24小时从阴茎背静脉给予RAGE抗体(1 mg/kg)治疗。以上后4组实验动物再分为4个亚组,分别于烫伤后1、3、5、7天处死动物,无菌留取血和脾脏标本。分离血清,-20℃贮存。脾脏一部分无菌、无酶液氮冻存,另一部分用于提取Treg、DC和T淋巴细胞。Treg、DC的分离纯化采用MiniMACS免疫磁性分离系统进行。利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性,分离T淋巴细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型和细胞表面受体,MTT法检测脾T淋巴细胞增殖,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、细胞孵育上清及组织匀浆液的细胞因子和T淋巴细胞活化的核因子(NF)-κB。采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 2.对106例烧伤总面积大于或等于30%的患者进行动态观察,对所采集临床病历资料进行分析。实验分组:⒈按烧伤总面积将患者分为三组:Ⅰ组41例(烧伤总面积30%~49%),Ⅱ组34例(烧伤总面积50%~69%),Ⅲ组31例(烧伤总面积70%~99%);⒉根据烧伤脓毒症的诊断标准,将患者进一步分为脓毒症组(59例)与非脓毒症组(47例);⒊根据脓毒症患者的预后情况,将其分为死亡组(17例)与存活组(42例)。同时设正常对照组(25位健康献血员)。分别于烧伤后1、3、7、14、21天采集患者外周静脉血,分离外周血T淋巴细胞,采用MiniMACS免疫磁性分离系统对外周血Treg进行分离纯化,同时分离血清,-20℃贮存。采用流式细胞术检测细胞免疫表型,MTT法检测T淋巴细胞增殖活性,ELISA检测血清HMGB1及细胞孵育上清的细胞因子水平,采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 结论: 实验一:⒈HMGB1在严重烫伤后具有升高较晚、持续时间较长的特征。HMGB1可能参与了烫伤后脓毒症所致多器官损害的发病过程。⒉HMGB1的持续升高可刺激Treg向成熟发展,从而介导T淋巴细胞增殖反应低下,并向Th2漂移,免疫功能抑制。⒊烫伤后大量的HMGB1可能主要通过受体RAGE介导Treg表型表达、Treg功能成熟。⒋HMGB1介导的Treg功能成熟可影响烫伤后DC细胞向成熟发育,但其表型表达异常,功能出现障碍。⒌HMGB1介导的Treg功能成熟还可通过下调T淋巴细胞NF-κB活性而减少了IL-2基因表达和蛋白合成,进而影响T淋巴细胞的增殖反应和免疫功能。⒍EP可能主要通过抑制HMGB1的合成释放,改善烫伤延迟复苏动物细胞免疫功能紊乱,保护动物的主要脏器功能。 实验二:⒈HMGB1在严重烧伤后具有增高较晚、持续时间较长的特征,其含量与烧伤严重程度、并发脓毒症及患者预后相关,HMGB1参与了严重烧伤后机体免疫紊乱、发生脓毒症并致患者死亡的病理过程。⒉严重烧伤后Treg功能向成熟发展,使其免疫抑制功能充分发挥,从而可能导致机体的免疫功能紊乱。其表面分子表达及细胞因子分泌在不同烧伤面积、是否并发脓毒症及是否存活等不同组间存在显著差异,Treg可通过分泌抑制性细胞因子参与了严重烧伤后机体免疫失衡、诱发脓毒症甚至最终造成患者死亡的病理过程。⒊严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能受到抑制,并引起T淋巴细胞向Th2漂移。烧伤程度越重、脓毒症发生率和患者死亡率越高,机体免疫抑制状态也越明显。⒋HMGB1含量与Treg及T淋巴细胞相关免疫指标均无明显相关,而Treg免疫指标与T淋巴细胞免疫功能指标间存在显著相关性(正相关或负相关).说明Treg可能对严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能低下,并出现Th1向Th2极化现象具有重要影响。
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