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葡萄糖浓度漂移对血管内皮细胞伤害程度及机制的研究
中文名称: 葡萄糖浓度漂移对血管内皮细胞伤害程度及机制的研究
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论文编号: 3767356收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study about the Glucose Density Intermittence Caused Vascular Endothelial Cell Damage Degree and Its Pathogenesis
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 波动 葡萄糖 内皮细胞 糖尿病 动脉粥样硬化 血管内皮细胞
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论文简介:糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱。并且往往合并动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)大血管并发症。高血糖是糖尿病的标志,也是导致糖尿病慢性血管并发症的主要因素。本研究通过观察在不同葡萄糖浓度状态下对培养的人脐静脉内皮细胞株凋亡,生存抑制率及形态学的改变,从基础领域方面探讨血糖漂移对血管内皮细胞的损害及引发动脉粥样硬化机制。 2型糖尿病的血糖增高,特别是血糖波动对心血管内皮细胞的损害已被人们证实。而血管内皮细胞并不只是血管内层的屏障,由于它具有分泌功能,所以已被认为是最大的内分泌器官。近年来研究发现基质金属蛋白酶-9作为一种降解细胞外基质的蛋白酶,能促进动脉粥样硬化(AS)斑块的形成,发展及破裂,在AS病变时增高。在葡萄糖浓度波动状态下MMP-9表达情况目前研究报告很少,故本研究通过培养内皮细胞和人髓系白血病单核细胞株THP-1在葡萄糖浓度波动状态下应用分子生物学技术测定MMP-9 mRNA.表达及蛋白水平的变化,以探求葡萄糖浓度漂移对对血管内皮细胞的MMP-9mRNA表达及蛋白量变化及其在2型糖尿病大血管病变中的作用。 实验方法: 1、细胞培养和计数 血管内皮细胞株ECV304购自中国培养物典藏中心。将冻存的血管内皮细胞株ECV304尽快解冻。加入含10%胎牛血清DMEM培养液10mL,混匀,1000转/min离心5min,弃上清用培养基稀释混匀,接种于培养瓶中,直至长满并融合成单层。用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液1:1消化,传代比例为1:2,其他条件不变。取对数生长期细胞,计数细胞后调整细胞数分别接种于250ml,50ml培养瓶及6孔,96孔培养板中待细胞均匀铺满容器底面后,分组实验。 2、实验分组 将上述培养细胞更换含1%胎牛血清的培养基中培养24小时,然后分四组:⑴5mmo l/L葡萄糖组;⑵20mmol/L甘露醇组;⑶20mmol/L葡萄糖组;⑷5mmo l/L葡萄糖和20mmo l/L葡萄糖每24小时交替培养组应用无血清培养基37℃5%Co,孵箱中培养14天进行实验。 3、MTT检测细胞存活率 将96孔培养板中培养的细胞每孔加入MTT溶液20μl37℃继续孵育4小时,然后吸去孔内上清液,加入150μlDMSO振荡10分钟。选择490nm波长在酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值。 4、细胞凋亡的检测 应用异硫氢酸荧光素标记膜联蛋白V(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡。PBS冲洗一次后,用1×结合缓冲液悬浮细胞至1×106/ml,取100μl细胞(1×105)稀释至5ml加入含5μl异硫氢酸荧光素标记膜联蛋白V(Annexin V-FITC/PI),10μl碘化丙啶(PI)混匀后,避光室温孵育15min,每管加入400μl,1X结合缓冲液,并上机检测。 5、吖啶橙(Ao)细胞荧光染色 取6孔培养板中盖玻片上的已经分组按上述方法培养的细胞,PBS洗三次,95%乙醇固定20min,1%醋酸作用30sec,加入0.01%AO染色5 min,PBS清洗1min,0.1mmol/L CaCl2分色2min,PBS清洗3次,甘油:PBS1:1封片,荧光显微镜下405nm滤光片立即观察。 6、RT-PCR法检测的mRNA表达 Trizol提取细胞总RNA,测OD260/OD28d,计算RNA浓度。取2μgRNA逆转录为cDNA,取cDNA2μl进行PCR扩增。反应体系为12.5μl,94℃预变性2min,94℃40sec,60℃40sec,72℃1min共35个循环,72℃终末延伸5min。取PCR产物5μl电泳分离后进行扫描分析,以β-actin条带亮度值进行标准校正,计算其相对表达量。 7、TGF-βl(ELISA方法)含量检测 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,分别将标本(标准品)100μl/孔加入,封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育90min。洗板4次,甩净孔内液体,每孔加洗涤液350μl,静置30sec甩净,在厚叠吸水纸上拍干。加入生物素化抗体工作液封住反应孔37℃孵育60 min,洗板,空白孔外加入酶结合物工作液(100μl/孔)封住反应孔,37℃孵育30min,洗板,加入显色剂37℃孵育20 min,加入终止液,测OD450值。 8、TGF-βl免疫组化检测 将上述培养于6孔板中盖玻片上14天人脐静脉内皮细胞应用95%乙醇固定过夜,30%过氧化氢水和100%甲醇混合液(1:50)室温浸泡30 min,以灭活内源性过氧化物酶。PBS冲洗2次,滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min,倾余,不洗,每张片滴加兔抗人TGF-βl多克隆抗体(1:50)4℃过夜;PBS冲洗,加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗,20℃孵育20 min,PBS冲洗;滴加链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液SABC 20℃20 min,PBS冲洗。DAB显色15 min,苏木素复染,中性树胶封片。 9、Westernblot定量检测 内皮细胞接种于250ml培养瓶中,于培养14天后将细胞收集。收集的细胞悬于250μl冰冷缓冲液中将细胞超声粉碎,4℃12000g离心60 min,沉淀。吸取上清,考马斯亮蓝法(Bradford法)测定样本中蛋白浓度,然后将每个样品中蛋白浓度调至相同。样品中加入样品缓冲液,沸水煮5 min,每个样品取20μl上样于lO%SDS-PAGE分离,BIO-RAD电泳板,双板条件为150V,30mA。TTBS洗膜2次,与HRP标记羊抗兔IgG(1:5000)室温孵育2小时。TBS洗膜2次,每次5min,加入显色液30min,采用Chemin Imager 5500型自动电泳凝胶成像分析仪采集图像并对蛋白显色光密度值IDV进行测定和结果分析。Bax和bc1-2操作方法与其相同。 10、统计学处理 应用SPSS12.0统计软件分析,数据采用-x±s表示。组间差异显著性比较t检验。 结论: 1、持续性高浓度葡萄糖将随着葡萄糖浓度的增高呈正相关诱导血管内皮细胞凋亡,而波动性高葡萄糖将比持续性高葡萄糖诱导血管内皮细胞凋亡率更高,所以,波动性高葡萄糖对血管内皮细胞的损害较持续性高血糖更严重。表示波动性高血糖是诱导血管内皮细胞凋亡的独立危险因子。 2、波动性高葡萄糖比持续性高葡萄糖更能促进抑制内皮细胞增殖的TGF-βl蛋白分泌及TGF-βl的mRNA表达。本研究提示波动性高血糖可能通过增加细胞炎症因子导致内皮细胞发生损伤,增加内皮细胞凋亡的。 3、通过与THP-1和EcV304细胞同时培养发现:波动性高葡萄糖使血管内皮细胞分泌MMP-9蛋白含量及MMP-9的mRNA表达较正常及稳定高血糖更高。 4、如上表示波动性高血糖是促进动脉粥样硬化发生的独立危险因子。
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