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Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸抑制大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的研究
中文名称: Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸抑制大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的研究
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论文编号: 3767324收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Research on Inhibiting Neointimal Hyperplasia by Decoy Oligodeoxynucleotide Egr-1mRNA after Balloon Injury of Rat Common Carotid Artery
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 诱骗性寡脱氧核苷酸 Egr-1 IGF-1 bFGF 动脉 血管内膜 血管内皮 大鼠
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论文简介:经皮腔内冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)是目前国内外广泛应用的治疗冠心病有效手段,但PCI术后半年内再狭窄(restenosis,RS)率高达10%--30%,严重影响其远期疗效。近年来随着分子生物学的发展,基因治疗很可能成为防治PCI术后RS的一种新策略。 Egr-1是一种锌指结构转录因子和DNA黏附蛋白。诱骗性寡脱氧核苷酸(decoyoligodeoxynucleotide,Decoy ODN)是一种顺式作用元件,与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似,在与转录因子与内源顺式DNA序列元件竞争,诱骗转录因子与它结合,下调转录因子所调控的基因表达。Decoy ODN作为一种新型的基因抑制剂在病理生理方面具有实际意义。 本研究设计了大鼠Egr-1mRNA的诱骗性寡脱氧核苷酸,作用于损伤后的颈总动脉内膜,观察其对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的抑制作用,并初步探讨其作用机制。 实验材料和方法: 1、实验材料 健康雄性Wistar大白鼠96只,体重350~400g;2F Fogarty导管;转染试剂FuGENE6;Egr-1兔抗大鼠单克隆抗体;bFGF羊抗大鼠单克隆抗体;IGF-1兔抗大鼠多克隆抗体;Decoy ODN;RNAout提取试剂盒;RT-PCR逆转录试剂盒;一氧化氮检测试剂盒和一氧化氮合酶检测试剂盒;内皮素分析试剂盒。 2、egr-1 Decoy ODN的基因序列为5,_TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG_3'对合;5,_CCCTTAGCGGGGGCGAGGGCGA_3';对照基因的序列:5'_AGCCGCACCGGCCTGCCTCGTC_3'对合;5,_GACGAGGCAGGCCGGTGCGGCT_3'。在其3'和5'端进行硫代修饰,5'端用FITC标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。 3、实验动物分组 96只雄性Wistar大白鼠随机分为4组,每组24只。治疗组;对照组;对照治疗组;假手术组;并于术后3、7、14、21天分别处死各组动物6只,处死前心脏采血备用。 4、动脉损伤模型的建立和Deco'y ODN治疗基因的在体转染10%水合氯醛腹腔注射(30mg/kg)麻醉后,造成左颈总动脉内膜损伤。结扎颈外动脉,恢复血流,缝合颈部创口。使用青霉素预防感染,喂食标准饲料,自由饮水。术后24h处死2只动物,取治疗部位的血管放于液氮中,制成冰冻切片。 5、取材与血管标本制作手术后不同时间点,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,无菌条件下游离左颈总动脉,用肝素盐水冲洗血管,部分血管用10%中性甲醛固定用于病理学检查,另一部分迅速放入液氮冷冻,-70℃保存,用于总RNA的提取和组织蛋白的检测。 6、N0、NOS水平和ET浓度的测定大鼠处死前心脏取动脉血4ml注入无抗凝剂和有抗凝剂试管中,离心后取血清及血浆备检。 7、血管标本的病理学检查石蜡包埋,从每段血管的横截面随机切下3张切片(片厚5μm),HE染色,光镜显微镜下观察血管内膜增生情况,并应用计算机图像分析软件进行图象分析,每个标本间隔取3张切片,测定内膜和中膜厚度,并计算狭窄率。 8、免疫组织化学染色采用辣根过氧化酶标记的链霉卵白素染色(SP)法进行Egr-1,Bfgf,IGF·1的免疫组织化学染色,以磷酸缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。 9、血管组织Eg-1,Bfgf,IGF-1蛋白含量的测定采用Western-blot方法。 10、血管组织Egr-1,Bfgf,IGF-1 Mrna含量的测定采用RT-PCR方法。扩增片段分别为Bfgf 231bp,Egr-1 449bp,IGF-1 bp281 bp,GAPDH,452bp,β-actin 400 bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量均为10μl,溴化乙锭染色,结果用凝胶成像分析仪进行分析,RT-PCR扩增的片段长度与预期的相符,将每份标本的Egr-1、Bfgf和IGF-1扩增条带与内参照GAPDH扩增条带的灰度值比作为Egr-1、Bfgf和IGF-1含量的相对值。 实验结果: 1、在体转染效果观察转染治疗基因24小时后,取治疗局部血管的冰冻切片置于荧光显微镜下观察,可见残存血管内膜及中膜有大量绿色荧光分布,证明转染成功。 2、血清N0、NOS及血浆ET测定结果球囊损伤大鼠颈总动脉后3、7、14、21天,治疗组血清NOS含量较两对照组高,且高于假手术组。治疗组血清NO含量较两对照组高,但较假手术组明显降低。治疗组血浆内皮素浓度较两对照组低,治疗组和两对照组血浆内皮素浓度较假手术组高,21天治疗组及两对照组血浆内皮素浓度已开始降低。 3、病理学检查结果大鼠颈总动脉拉伤后,可见内皮剥脱,说明球囊拉伤动脉模型成功;在假手术组,血管内膜由一层完整的内皮细胞覆盖;在对照治疗组和对照组7天时可见内膜增生,14天、21天时内膜增生更明显,两组比较差异无显著性。治疗组与同一时间点对照治疗组和对照组相比,两者之间差异有显著性(P<0.01)。 4、免疫组化结果正常动脉未见Bfgf表达,IGF-1及Egr-1呈微量表达;动脉损伤后14天,新生内膜及中膜中Bfgf阳性表达达到高峰,14天后逐渐下降;IGF-1阳性表达14天达到高峰;Egr-1呈持续高表达。经Decoy ODN作用后,动脉中Bfgf、IGF-1及Egr-1表达减少,与对照组和对照治疗组比较差异有显著性(P<0.001)。 5、在假手术组,Egr-1无蛋白条带;球囊损伤后3天有微弱的蛋白条带;7、14、21天Egr-1的蛋白条带灰度明显增加;治疗组各时间点蛋白条带灰度较对照组和对照治疗组减弱(p<0.05)。Bfgf是一分子量36 kDa的蛋白质。在假手术组,Bfgf无蛋白条带;球囊损伤后3、7、14、21天Bfgf蛋白条带灰度增加,以14天最为明显;治疗组各时间点蛋白条带灰度较对照组和对照治疗组减弱(p<0.05);IGF-1 25kDa的蛋白质,球囊损伤后IGF-1蛋白条带灰度增加,14天最为明显;治疗组各时间点蛋白条带灰度较对照组和对照治疗组减弱(p<0.05)。 6、血管壁组织的Egr-1、Bfgf和IGF-1 Mrna表达假手术组大鼠动脉有Egr-1、IGF-1 Mrna的微弱表达,无Bfgf Mrna表达;球囊损伤后Egr-1、Bfgf和IGF-1mRNA明显增加。Egr-1mRNA呈持续而明显的增高;Bfgf Mrna表达以14天时最为明显,14天后开始降低。IGF-1 Mrna以14天时最为明显,14天后开始降低。经Decoy ODN治疗后在各个时间点Egr-1、Bfgf、IGF-1 Mrna表达减少,与对照组和对照治疗组比较有显著差异(p<0.05)。 讨论: PCI术是目前解决缺血心肌再灌注的主要措施,但导管在血管内的操作将不可避免地造成内皮的损伤,内皮损伤后,各种转录调节基因随之激活(如:Egr-1),平滑肌细胞开始增殖并分泌细胞外基质,形成增厚的新生内膜。阻断这些转录调节基因的表达,以抑制平滑肌细胞的增殖,减轻内膜的增生,以达到阻止再狭窄的目的。我们选择Egr-1作为干预再狭窄治疗的理想靶点。因此本研究设计了针对大鼠Egr-1的Decoy ODN,作用于损伤后的动脉内膜,观察其治疗其治疗效果。 实验发现,应用ED5治疗后可以减少血管损伤后的ET释放。实验亦发现Decoy ODN可以增加血管损伤后NO和NOS的释放量,NO与NOS的增加一致,与NOS催化L-精氨酸合成释放NO的观点一致;而血管损伤后治疗组及对照组NOS的释放量均高于假手术组,考虑是血管损伤后为维持损伤血管的张力及减少血栓形成的一种代偿机制。本研究的结果也发现血管损伤后有不同程度的内膜增厚,官腔变窄;透射电镜发现正常颈动脉血管SMC呈收缩型,核呈梭形,胞质含大量肌丝,在核两端有少量线粒体;血管损伤后SMC胞体肥大,核明显增大,胞浆内线粒体、高尔基体等增多,而肌丝含量减少,呈合成型;Decoy ODN治疗组的SMC胞体及核较小,胞浆内肌丝含量相对较多,线粒体、高尔基体亦较少,接近收缩型的SMC。表明Decoy ODN通过抑制Egr-1的表达,调控VSMC的表型变化,从而抑制VSMC的过度增殖和内膜增生,因此减轻了血管损伤后的内膜增生程度。 本研究结果表明,正常的血管壁有Bfgf微量表达,血管损伤后Bfgf的表达上调,14天达高峰,Decoy ODN治疗后其表达减少。因此表明Decoy ODN-这种新型的RNA水平上的强效基因灭火因子,通过抑制Egr-1的表达,在某种程度上也抑制了Bfgf的转录和表达,来抑制动脉损伤后新生内膜的增生。本研究亦发现大鼠球囊血管损伤后IGF-1的高表达,14天最明显。Decoy ODN治疗后IGF-1的表达下降这可能与Egr-1控制IGF-1基因的表达有关。 结论: 1 Decoy ODN可能是通过降低ET分泌量,增加NO及NOS的含量,从而间接发挥改善血管内皮功能的作用,达到减轻新生内膜厚度,预防再狭窄的目的。 2 Decoy ODN可能是通过影响血管平滑肌细胞表型的改变来减轻动脉损伤新生内膜的增生,从而预防再狭窄。 3 Decoy ODN可能是通过特异性抑制其相应基因的表达来阻遏动脉损伤后的内膜增生。
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