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乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株变异率快速检测方法的建立及应用研究
中文名称: 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株变异率快速检测方法的建立及应用研究
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论文编号: 3767299收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Development of a Rapid Method for Quatitation of Lamivudine-resistant Mutations in Hepatitis B Virus and Its Application
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化工
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 乙肝病毒 PCR YMDD 肝组织 乙型肝炎病毒 拉米夫定耐药株 变异率
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论文简介:全世界有3.5亿乙肝病毒感染者。乙肝病毒(HBV)是导致肝硬化和肝癌的重要因素,60%~-80%的肝癌患者是乙肝病人。随着对乙肝病毒治疗的深入研究,各种抗病毒药物应运而生。拉米夫定是有效抑制乙肝病毒复制的核苷类似物之一。但是,长时间用药会导致乙肝病毒出现YMDD区段发生变异,即HBV逆转录酶的保守序列YMDD中M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)所取代,变异后成为YVDD(rtM204V)或YIDD(rtM204I),导致HBV对拉米夫定产生耐药,使患者体内病毒复制反弹。 本研究通过设计变异位点的选择性引物及共用探针,利用荧光定量PCR技术,建立了一种快速、有效的乙肝病毒YMDD变异率的检测方法。突变毒株在病毒群体中的百分比可以根据突变株和对照的Ct值差异进行计算。包含耐药突变的质粒经过系列稀释、混合后进行检测,以及对未经拉米夫定治疗的98例慢性乙肝患者和145例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药突变检测,与测序方法进行对照,对结果不符的标本再进行亚克隆测序验证。并用该方法对268例经拉米夫定治疗的不同时间患者进行病毒变异率检测。对98例经拉米夫定治疗和64例经拉米夫定与干扰素a序贯治疗的e抗原阴性患者进行病毒变异率检测,验证序贯治疗的效果及其对拉米夫定变异的抑制作用。同时,对患者体内的T淋巴细胞活性及T淋巴细胞亚群情况、肝组织治疗前后病理学变化等进行了进一步分析。 该方法可以在106~109拷贝/毫升HBV的血清标本中检测到0.1%的突变毒株。145例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中,检测到42例耐药突变株,突变比例为5~10096。6例与测序结果不符的标本突变比例为5~20%,低于测序方法的检测下限,与亚克隆测序的结果相符。98例未经拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中有5例检测到耐药突变,变异比例为10~20%。拉米夫定治疗组的拉米夫定耐药株变异率(22.45%)显著高于序贯治疗组。 实验结果表明,本研究所建立的拉米夫定耐药株变异检测方法快速灵敏,可以用于临床治疗中拉米夫定耐药变异的监测,为临床治疗方案的选择提供可靠依据。
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