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四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子机制及人ALT同工酶分子克隆、蛋白表达、纯化及相关研究
中文名称: 四氯化碳引起小鼠血清ALT升高的分子机制及人ALT同工酶分子克隆、蛋白表达、纯化及相关研究
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论文编号: 3767271收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Molecular Mechanism of Serum ALT Elevation in Mice Treated with Carbon Tetrachloride and Human ALT Isoenzymes: Molecular Cloning, Protein Expression and Purification and Related Study
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 劳动卫生与环境卫生学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 丙氨酸氨基转移酶 同工酶 四氯化碳 肝损害 ALT活性 重组蛋白纯化 肝脏损害
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论文简介:在本研究中,首先检测SD大鼠ALT同工酶在多种组织中的蛋白分布,然后采用一种经典的职业肝损害毒物CCl4急性腹腔注射C57816小鼠,观察处理前后血清ALT同工酶蛋白变化;其次,克隆hALT1和hAT2 cDNA,并转入昆虫细胞中表达重组hALT1和hALT2蛋白,然后进行纯化,并对其进行初步的特性识别;通过前一部分产生的重组hALT1和hALT2蛋白制备并纯化特异性的hALT1和hALT2多克隆抗体,并利用这两种特异性抗体去检测人血清中ALT同工酶的蛋白表达,探讨肝损害时血清ALT升高的分子机制,为将来对于血清ALT改变在职业性肝损害、非职业因素引起的肝损害或者正常与疾病状态的研究提供必要的基础资料。血清ALT同工酶蛋白的测定,可能对于诊断职业性肝损害或非肝损害的性质和程度提供了一个新的前景。 材料与方法: 1、实验动物样品制备 10只Sprague-Dowley(SD)大鼠,取肝脏、肌肉、脑组织、小肠、肾、心脏、结肠、棕色脂肪和附睾白色脂肪组织,约0.2mg组织加入1ml NP40裂解液匀浆后,3,000xg,4℃离心10min,取上清,测定组织蛋白浓度,调整样品蛋白浓度为20μg/3μl。4只8周龄雄性C57816小鼠,按2ml/kg体重腹腔注射CCl4,24h后取血清。 2、血清和肝组织ALT活性测定 利用ALT活性与单位时间内NADH下降的吸光度呈正比,采用HTS 7000 BioRad reader测定仪测定活性,测定波长340nm,组织ALT活性以组织细胞裂解液的蛋白浓度进行校正,单位为U/mg蛋白。 3、Westem blot分析 向加样孔中依次加入预染的蛋白Marker及蛋白样品,电泳,转印,5%脱脂牛奶封闭、一抗,4℃摇动孵育过夜;再加入过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,摇床上室温摇动45min,暗室中ECL显影,洗片,胶片拍照后用凝胶成像分析系统进行灰度值定量分析。 4、载体构建 全长hALT1 cDNA和去除线粒体信号的hALT2 cDNA分别克隆入pBAC-2cp中,该载体具有6×His-tag序列和牛肠激酶的酶切位点,有助于纯化及去除His-tag。分别命名为pBAC-2cp-hALT1和pBAC-2cp-hALT2。 5、产生重组病毒 pBAC-2cp-hALT1和pBAC-2cp-hAIX2分别转染Sf9昆虫细胞,重组病毒扩增至第4代,进行病毒滴度测定。 6、重组蛋白在High5昆虫细胞中的表达及蛋白纯化 利用重组hAlT蛋白中含有的6×His tag能够与Ni2+特异结合的特性,先将细胞上清液过柱子,大部分不与Ni2+结合的蛋白则最先流出,再用含不同浓度Imidazole的E1ution buffer逐步洗脱结合在柱子上的蛋白,随着Imidazole浓度的增加,含6×His tag的重组hALT蛋白则被洗脱,达到分离纯化蛋白的目的。并进行ALT活性测定、SDS-PAGE和Western blot证实纯化蛋白;牛肠激酶对6×His-tag的重组纯化蛋白进行酶切,再用Ni-NTA agarose纯化酶切后的蛋白。 7、纯化重组蛋白的基本特性识别 ⒈温度储存条件对ALT活性的影响 将纯化后的重组蛋白并已去除6×His-tag的hALT1和hALT2分别放入Tris-HCl buffer(20mM Tris-HCl,pH 7.5),在-80℃、-20℃、4℃、25℃和37℃条件下储存24h、48h、6days、10days、15days和20days,分别测定ALT活性。 ⒉储存条件对ALT活性的影响 将纯化后的重组蛋白放入含不同浓度甘油(0~30%)的20 mM Tris-t-Icl buffer,pH7.5中,在-20℃放置24h和48h,分别测定ALT活性。 ⒊pH值对ALT活性的影响纯化的重组蛋白在pH值从5~9的测定试剂(125mM Tris-HCl,575mM丙氨酸,16.3mM α-酮戊二酸,0.25mM NADH,>3000ULDH)中检测ALT活性。 以上操作均做3个平行样,计算结果取平均值。 8、hALT1和hALT2多克隆抗体的制备及纯化 由美国AbboMax公司生产抗体,再自行纯化。先将hALT1多克隆抗体过偶联重组hALT2蛋白的柱子,再将流出的抗体过偶联上重组hALT1蛋白的柱子,然后再用pH 2.7和1.9的Elution buffer将抗体洗下,并马上用Neutralization buffer中和,即为纯化后的hALT1抗体;同理,纯化hALT2抗体。 9、正常健康受试者和肝损害患者血清ALT活性及ALT同工酶蛋白检测 采集4名健康志愿者及4名临床肝活检确诊肝损害患者的空腹血清,检测ALT活性,Westernblot测定血清中ALT同工酶蛋白表达 10、统计学处理 统计结果以均数±标准误表示,SPSS 13.0统计学软件进行分析,数据两两比较采用独立样本t检验及配对样品t检验。 结论: 1、ALT同工酶蛋白在大鼠组织中广泛表达,且ALT1比ALT2具有更广泛的组织分布;小肠中仅表达ALT1,且表达量非常高,但却无ALT2表达。肝脏ALT2蛋白表达存在性别差异,雄性大鼠显著高于雌性大鼠;雄性大鼠肝脏ALT活性也显著高于雌性大鼠。CC14处理小鼠血清ALT1和ALT2蛋白增加。 2、hAIT1和hALT2重组蛋白可以通过Ni2+螯合柱,经Imidazole梯度洗脱一步纯化。与hALT1相比,hALT2重组蛋白不稳定并且很难通过调整pH值来分别测定ALT同工酶活性。 3、在当前测定条件下,如果组织或血清样品ALT1和ALT2蛋白水平相当,那么所测得的ALT活性主要来源于ALT1。 4、正常健康志愿者及肝损害患者血清中均可检测到ALT同工酶蛋白;肝损害患者血清ALT活性及ALT1蛋白表达显著升高,ALT2蛋白表达也较正常健康志愿者高,但并无显著性差别。高ALT活性肝损害患者ALT同工酶蛋白的表达增加,但与活性并不成一致的相关。
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