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苦参碱抑制人恶性黑素瘤A375细胞株侵袭转移的体外实验研究
中文名称: 苦参碱抑制人恶性黑素瘤A375细胞株侵袭转移的体外实验研究
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论文编号: 3444379收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Inhibitory Effects of Matrine on Invasiveness and Metastasis of Human Malignant Melanoma Cell Line A375 in Vitro
学位类型: 硕士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 皮肤病与性病学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 黑素瘤 苦参碱 细胞 培养的 细胞凋亡 乙酰肝素酶 黏附
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论文简介:本实验分为二部分: 第一部分 苦参碱对人恶性黑素瘤A375细胞株增殖和凋亡的影响 恶性黑素瘤(Malignantmelanoma,MM)是一种高度恶性的肿瘤,易经淋巴道或血道广泛转移,死亡率极高。然而MM的确切病因尚不清楚,目前尚缺乏有效的治疗手段,寻找有效的药物和治疗手段是当务之急。苦参碱作为我国传统中药苦参的重要组成成分,具有良好的药理活性,特别是抗恶性肿瘤的活性日益引起人们的兴趣,有关实验和临床研究方兴未艾。但苦参碱对MM细胞增殖和凋亡影响的相关研究罕见报道。本研究以体外培养的人恶性黑素瘤A375细胞(以下简称A375细胞)为研究对象,观察苦参碱对MM细胞增殖和凋亡的影响。 方法 1、MTT法检测苦参碱对A375细胞增殖的作用 设0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL苦参碱干预组,对照组仅加等量的培养液,各浓度复4孔。每隔2d更换含同样药物浓度的新鲜培养液,分别培养1-6d,加入MTT继续孵育4h后,酶标仪测570nm吸光度(A)值。实验重复3次。细胞增殖抑制率=(对照组A值-处理组A值)/对照组A值×100%。 2、流式细胞仪检测苦参碱对A375细胞凋亡的作用 设对照组及0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL苦参碱干预组,各浓度复3瓶。药物作用48h后收集细胞,取100μL细胞悬液于5mL流式管中,加入Annexin-V-FITC和PI各5μL,室温避光孵育15min后在流式细胞仪上测定。实验重复3次。 3、细胞形态观察 设对照组及0.25mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL苦参碱干预组。药物作用48h后收集细胞。10%甲醛固定,HE染色,倒置光学显微镜下观察细胞形态。用2.5%的戊二醛固定2h,固定脱水包埋后,透射电镜下观察细胞超微结构。 4、统计学处理 数据以x±s表示。应用SPSS10.0统计软件包进行方差分析。显著性检验水平为α=0.05。 结果 1、苦参碱对A375细胞增殖的抑制作用 苦参碱在一定浓度范围(0.5~2.0mg/mL)能显著抑制A375细胞的增殖,且其增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性。而低浓度的苦参碱(≤0.25mg/mL),即使作用时间延长,其增殖抑制作用仍然很弱。 2、流式细胞仪的检测结果 在浓度为0.5~1.0mg/mL时苦参碱能诱导A375细胞凋亡,其作用呈浓度依赖性。 3、苦参碱作用前后A375细胞形态学的改变 光镜和电镜均观察到苦参碱作用后A375细胞的凋亡现象,且在1.0mg/mL时胞浆内可出现胞质空泡样变。 结论 1、苦参碱能抑制人MM细胞的体外增殖,其抑制作用在一定浓度和时间范围内表现出时效与量效关系。 2、苦参碱在体外能诱导人MM细胞发生凋亡,其作用在一定范围内呈浓度依赖性。 第二部分苦参碱对人恶性黑素瘤A375细胞株侵袭能力及乙酰肝素酶mRNA表达的抑制作用 近年来的研究结果显示苦参碱具有能抗肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡、抑制肿瘤新生血管形成的作用,但有关其抗肿瘤浸润转移方面的研究文献甚少报道。乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)是一种糖苷内切酶,是参与细胞外基质及基底膜降解,协助癌细胞转移的关键酶。本实验以A375细胞株为工作模型,观察不同浓度苦参碱干预后MM细胞HPSE表达以及细胞侵袭能力的改变,探讨苦参碱抑制肿瘤侵袭转移的作用机制。 方法1、半定量逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)检测HPSE-mRNA的表达 设对照组及0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL苦参碱干预组。药物作用48h后收集细胞。抽提细胞总RNA,进行逆转录和PCR扩增;HPSE扩增35个循环,其扩增片段长度为584bp;以β-肌动蛋白为内参照,扩增30个循环,其扩增片段长度225bp。实验重复4次。 2、细胞黏附实验 96孔板每孔铺Matrigel凝胶10μg(30μL),用2%BSA20μL封阻。收集并接种药物作用满48h的A375细胞,设对照组及0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL苦参碱干预组,各组复4孔。37℃培养1h后,PBS洗去未黏附细胞,加入MTT继续孵育4h后,酶标仪测570nm吸光度(A)值。实验重复3次。细胞黏附抑制率=(对照组A值-处理组A值)/对照组A值×100%。 3、Matrigel侵袭实验 Boyden小室底部铺上Matrigel凝胶(1mg/mL)100μL,置于24孔板内风干。收集A375细胞以无血清RPMI1640制成2×105/mL单细胞悬液,取100μL移入小室,设对照组及0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL苦参碱干预组,各组复4孔。孵育48h后以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞,固定染色后在400倍高倍镜下计数,随机6个视野/孔或膜。侵袭细胞数=各下室面黏附的细胞数+相应24孔板黏附的细胞数,细胞侵袭抑制率=(对照组侵袭细胞数-处理组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%。 4、统计学处理 数据以x±s表示。应用SPSS10.0统计软件包进行方差分析。显著性检验水平为α=0.05。 结果1、苦参碱对A375细胞HPSE-mRNA表达的抑制作用 对照组和各苦参碱干预组的HPSE/β-actin光密度比值分别为1.45士0.12、1.01士0.13、0.65±0.01、0.32±0.08。与对照组比较,苦参碱各浓度组HPSE-mRNA表达量均显著降低,而且随着苦参碱浓度的增加,HPSE-mRNA表达量逐渐下降,苦参碱的抑制作用具有明显的剂量依赖性。 2、苦参碱对A375细胞黏附力的抑制作用 与对照组比较,各实验组培养细胞黏附Matrigel凝胶的能力明显降低,其抑制率分别为26.17±1.77%、50.01±5.68%、73.07±3.24%。苦参碱对A375细胞黏附力的抑制作用呈剂量依赖性。 3、苦参碱对A375细胞侵袭力的抑制作用 0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL苦参碱对A375细胞侵袭力的抑制率分别为27.47±2.55%、53.76±2.18%、87.09±1.00%。与对照组比较,各浓度苦参碱干预组侵袭细胞数均明显减少,且苦参碱干预组组间差异显著。 结论1、苦参碱能下调A375细胞HPSE-mRNA的表达,其抑制作用呈剂量依赖性。 2、体外研究表明苦参碱能显著抑制A375细胞的黏附和侵袭能力,其抑制效应与药物的浓度呈正相关。 3、苦参碱可能通过下调A375细胞HPSE-mRNA的表达而显著抑制细胞的黏附、侵袭能力。
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