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应用人类腺病毒基因E1A转染构建永生化人近曲小管上皮细胞株
中文名称: 应用人类腺病毒基因E1A转染构建永生化人近曲小管上皮细胞株
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论文编号: 3444357收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Immortalization of Human Proximal Tubule Cells by Transfection of Human Adenovirus 5 E1A Gene
学位类型: 硕士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 肾内科
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 永生化 近曲小管上皮细胞 人类腺病毒早期基因E1A基因转染 基因转染 生长特性 转染 重组质粒构建
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:目的用人类腺病毒5早期基因E1A(ad5E1A)转染构建永生化人近曲小管上皮细胞株,并测定其生长特性与功能。方法人胚肾细胞株(293细胞)培养后,用RT-PCR方法扩增出ad5E1A基因。KpnI和EhoI双酶切后与pShuttleCMV载体连接。连接成功并测序无误后应用Lipofectamine转渎雁襨圸抔萀E渎雁襨圸抔皮细胞,筛选出阳性克隆,RT-PCR鉴定目的基因的表达,免疫荧光测定蛋白表达。并用MTT及流式细胞仪测定其生长特性。通过AKP、LDH、NAG及钠钾ATP酶的检测明确转化后细胞的功能并与HK2细胞株作比较。结果RT-PCR方法成功从293细胞扩增出ad5E1A基因。经双酶切与载体连接后,测序结果证明重组质粒构建成功,阅读框架正确。随后应用Lipofectamine转染成功筛选出阳性克隆,能持续生长并稳定传代30代以上。RT-PCR证实ad5E1A基因在转化后细胞的表达,免疫荧光证明了ad5E1A蛋白的表达。MTT测定结果显示ad5E1A表达的人近曲小管上皮细胞与对照组细胞相比,生长速率均明显增快,自48小时起即与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。流式细胞仪结果显示转化后细胞G0/G1期比例明显减少,较对照组有显著差异(P<0.05)。转化后细胞的AKP、NAG、钠钾ATP酶活性均高于HK2细胞株(P<0.05)。结论利用ad5E1A基因转化原代培养人肾近曲小管上皮细胞具有可行性,转化后的细胞具有永生化特征,其部分功能优于HK2细胞株。
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