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抗尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定
中文名称: 抗尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定
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论文编号: 3444279收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Generation and Characterization of Monoclonal Antibody Against Nicotinamide N-methyltransferase
学位类型: 硕士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 检验诊断学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 尼克酰胺-N-甲基转移酶 杂交瘤 单克隆抗体 特性分析 Western-blot ELISA 免疫组化 肾癌 甲状腺癌
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论文简介:尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)是催化药物、异型生物质甲基化的一种S-腺苷蛋氨酸依赖性胞质酶,主要分布于肝脏,在体内主要催化尼克酰胺。近年来研究发现,帕金森综合症(PD)病人脑组织中NNMT表达明显增高。PD患者的脑脊液中NNMT含量也显著增高,其含量明显受到年龄的影响,会随患者年龄增加而降低。现在普遍认为,中枢神经系统中NNMT过量可能是帕金森综合症发病机制之一。有学者检测了肾癌和正常肾组织的基因表达框架后发现透明细胞型肾癌,嫌色细胞型肾癌和正常肾组织均有独特的基因表达框架,NNMT表达水平在透明细胞癌中比后两者高出三倍多。而且在透明细胞型肾癌中NNMTmRNA水平也显著增高。还有学者发现,编码NNMT的基因在乳头状甲状腺癌细胞株中高表达。同时对人类甲状腺标本NNMT进行免疫组化染色后发现,在乳头状甲状腺癌区域免疫组化显示胞浆反应强阳性。另有学者检测了放疗抵抗性膀胱癌细胞株及放疗敏感性亚克隆中的DNA修复基因后发现,膀胱癌放疗敏感性克隆中NNMT表达会下调。因此,NNMT可能成为辅助诊断帕金森综合症、透明细胞型肾癌、乳头状甲状腺癌及区分膀胱癌是否为放疗敏感性的一个生物标志。 制备NNMT的单克隆抗体为建立免疫学检测方法检测几种疾病血液、体液中的NNMT蛋白含量作了必要的准备,还可将其应用免疫组化技术分析各种组织中NNMT的表达,这将对肾癌等疾病在亚型诊断及疾病预后方面有很大的帮助。目的:研制抗尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用B淋巴细胞杂交瘤技术,以NNMT-GST融合蛋白及NNMT蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经PEG融合,在HAT选择培养基中培养,用间接ELISA方法鉴定阳性克隆,用有限稀释法使阳性杂交瘤进一步克隆化筛选出阳性杂交瘤细胞株。以动物体内诱生获得腹水的方法制备抗体,用辛酸-硫酸铵提取法纯化腹水获得纯品抗体,并通过凝胶扫描分析其纯度。用HyCultbiotechnology鼠单抗定型试剂盒鉴定抗体的亚型及轻链型;用Western-blot法检测单克隆抗体的特异性;用间接ELISA方法测定抗体的滴度并进行相对亲和力分析;用免疫组织化学法检测正常肝脏组织及透明细胞型肾癌组织、乳头状甲状腺癌组织中NNMT的表达。结果:获得了两株(2F8、1E7)能稳定分泌抗NNMT的杂交瘤细胞株。收集腹水后制备的纯品抗体滴度及纯度较高,2F8株抗体效价达1∶51200,纯度为85.6%;1E7株抗体效价达1∶12800,纯度为90.2%。Western-blot法证实两株细胞分泌的抗体均有高度特异性。2F8及1E7两株细胞分泌抗体的亚型分别为IgG2bκ和IgG2aκ。比较两株细胞分泌抗体的相对亲和力为2F8>1E7。免疫组化结果显示,正常肝脏组织及透明细胞型肾癌组织、乳头状甲状腺癌组织中NNMT均显阳性表达,而正常肾脏组织及甲状腺组织中显阴性。结论:成功地研制了抗人NNMT的单克隆抗体细胞株,并制备出了单克隆抗体,同时用Western-blot、免疫组化等方法鉴定了其生物学特性。鉴定结果表明所获单抗具有高度的特异性和一定的实用性,可能在一些肿瘤的亚型诊断、预后判断方面具有应用潜力。
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