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天花粉蛋白抑制HeLa细胞生长及诱导细胞凋亡机制研究
中文名称: 天花粉蛋白抑制HeLa细胞生长及诱导细胞凋亡机制研究
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论文编号: 3444276收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Growth Inhibition and the Apoptosis of HeLa Cells with Trichosanthin
学位类型: 硕士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 人体解剖学与组织胚胎学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 天花粉蛋白 HeLa细胞 细胞凋亡 细胞周期 组织胚胎学 中草药 药理学
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论文简介:天花粉作为一种传统的中草药,在我国入药历史悠久,主要应用于引产。上世纪80年代,天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)被证实为药物的有效成分。天花粉蛋白,是一种单链的核糖体失活蛋白,含247个氨基酸残基,通过N-糖苷酶活性使真核细胞的核糖体失活。一直以来,天花粉蛋白在临床上主要应用于中期引流和治疗异位妊娠、胎盘残留以及滋养层细胞肿瘤。近年来,研究发现,天花粉蛋白具有多种药理学活性,包括免疫调节、抗肿瘤和抗HIV。为此,天花粉蛋白已受到广泛的关注。 本研究将特别关注天花粉蛋白的抗肿瘤活性及其机制。天花粉蛋白对多种肿瘤有抗癌活性,如绒毛膜细胞癌、肝细胞癌,以及其他消化道肿瘤等。最初的研究发现,天花粉蛋白对绒毛癌JAR细胞的损伤作用,在于其对细胞核糖体有特异的损伤作用。随后又发现天花粉蛋白可以通过诱导JAR细胞凋亡而发挥其抗癌作用。由此可见,天花粉蛋白目前的抗癌作用研究主要集中在绒毛膜细胞癌和消化道肿瘤上,而有关它对其它肿瘤细胞作用的研究报导尚不多见。而且有关天花粉蛋白的抗癌机制尚不确定。为此,我们选择了HeLa细胞(人宫颈癌细胞)为研究对象,观察天花粉蛋白对其生长的抑制作用,并且从细胞凋亡和细胞周期两个方面来研究天花粉蛋白抑制HeLa细胞生长的机制,并进一步探讨天花粉蛋白诱导细胞凋亡的机理。 细胞的增值、凋亡、分化和衰老均是细胞周期依赖性的,所以,从天然药物中,特别是中草药,筛选能够调节细胞周期,并且引起细胞凋亡,从而抑制细胞生长的药物,将是今后抗肿瘤治疗最理想的途径。本实验在药物对细胞生长作用研究的基础上,首次研究了天花粉蛋白对HeLa细胞诱导凋亡和细胞周期阻滞的作用,并进一步探讨其诱导凋亡的机制,为天花粉蛋白在肿瘤防治中的应用提供重要的实验依据,同时为天花粉蛋白的抗癌机制提供新的研究途径。 研究目的 研究天花粉蛋白对人宫颈癌HeLa细胞的生长抑制作用,从细胞凋亡和细胞周期两个方面来考察细胞生长抑制的机制,并进一步探讨天花粉蛋白诱导HeLa细胞发生凋亡的分子机制。 研究方法 采用CCK-8的方法,检测TCS对HeLa细胞的抑制作用;流式细胞仪检测TCS对细胞周期的影响;电子显微镜和Annexin法观察TCS对HeLa细胞诱导凋亡的作用;应用Westernblot和RT-PCR法观察HeLa细胞Caspase-3酶原和mRNA的表达变化;用Caspases活性检测试剂盒,检测Caspase-3,8,9的活性。 研究结果 ⒈TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用。随着时间的延长、浓度的增加,抑制作用明显加强,呈显著的时间和浓度依赖性。HeLa细胞经TCS100μg/ml作用24h,细胞生长抑制率为31.6±3.92%,而作用48h,细胞杀伤率达49.34±4.49%。此外,随着作用时间的延长,TCS对HeLa细胞的半数抑制浓度明显下降,其中TCS作用36h,IC50是191.46μg/ml;TCS作用48h,IC50为101.34μg/ml。⒉流式细胞术分析显示,同一浓度(100μg/ml)TCS作用HeLa细胞24、36和48h,随着TCS作用时间的延长,S期细胞比例也随之增高,G2/M期细胞所占比例相应减少;不同浓度的TCS作用HeLa细胞48h,发现50、100μg/mlTCS作用后,S期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例相应减少。⒊100μg/mlTCS作用HeLa细胞24h后,细胞膜表面的微绒毛减少,细胞核固缩变形,染色质浓缩成块状,边集于核膜。TCS作用48h后,细胞膜表面出现典型的细胞凋亡特征——微绒毛基本消失,胞膜发泡,并可见凋亡小体,核染色质高度浓缩,核膜消失,出现广泛的空泡化和一个非常光滑的表面。⒋同一浓度(100μg/ml)TCS作用HeLa细胞24、36和48h,细胞凋亡率随着作用时间的延长而逐渐增高;不同浓度的TCS作用HeLa细胞48h,药物诱导细胞凋亡的作用呈现浓度依赖性增高的趋势。100μg/mlTCS作用48h,HeLa细胞凋亡率达到最高的42.52%。⒌同一浓度(100μg/ml)TCS分别作用HeLa细胞24、36、48h和不同浓度TCS分别作用HeLa细胞48h后,Caspase-3酶原蛋白条带逐渐变细,经图像分析后发现,Caspase-3酶原和内参照β-actin的光密度积分值之比有减少的趋势,呈现时间和浓度依赖性。结果提示,在TCS诱导HeLa细胞凋亡的过程中,Caspase-3酶原发生了裂解而被活化。⒍用100μg/ml的TCS分别处理HeLa细胞12、24、36和48h后,随着作用时间的延长,各组Caspase-3mRNA的条带逐渐变粗,经图像分析可见,各浓度组的Caspase-3mRNA和β-actin光密度积分值之比有随着浓度增加而增高的趋势。⒎比色法检测Caspases活性的结果显示,Caspase-3,8,9活性均有时间依赖性增高的趋势。100μg/mlTCS处理24h后,Caspase-8的活性最高,且明显高于对照组;而同样浓度处理36h后,Caspase-3的活性开始高于对照组,至48h达到高峰(是对照组的2.8倍)。Caspase-9的活性是在100μg/mlTCS作用36h后才明显高于对照组的,但显著低于Caspase-3。这些结果提示,Caspases的激活具有时间顺序,且Caspase-8,9可能参与了Caspase-3的活化过程。 结论 本实验结果发现,TCS对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用,其作用机制可能有二,一是由于TCS可以俘获S期的HeLa细胞;二是TCS可诱导HeLa细胞发生凋亡。在TCS诱导HeLa细胞凋亡的过程中,Caspase-3的激活是介导HeLa细胞发生凋亡的共同通路。同时,活化的Caspase-8,9可能参与了Caspase-3的激活,从而诱导凋亡的发生。
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