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LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用
中文名称: LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用
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论文编号: 3444269收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Identification and Immunoprotective Effect of Prokaryotic Expression Product of LTB-hpaA Fusion Gene
学位类型: 硕士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病原生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 幽门螺杆菌/hpaA基因 大肠杆菌/ItB基因 融合基因 克隆/表达 免疫原性/佐剂活性 动物感染模型 免疫保护 幽门螺杆菌
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论文简介:幽门螺杆菌是微需氧的革兰阴性杆菌,呈螺旋状。多数国家和地区Hp感染率高达50%以上,许多感染者都是无症状的,但是有部分感染者可出现急慢性胃炎和消化性溃疡,Hp的持续性感染还与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生密切相关。目前关于Hp疫苗的研究较少。 Hp粘附素是细菌鞭毛鞘膜蛋白,也是细菌主要的粘附因子之一。hpaA基因位于细菌基因组DNA上,其核苷酸或氨基酸序列高度保守,并且有研究发现在大约86%的Hp患者血清中可检测到HpaA抗体,因此可作为Hp基因工程疫苗的侯选抗原。 基因工程疫苗多以单一蛋白作为抗原,其免疫效果常不尽人意,通常需要使用佐剂来提高此类疫苗的免疫效果,有文献报道LTB粘膜免疫佐剂活性明显高于CTB,因此LTB作为疫苗佐剂更为合适。 材料方法: 1.菌株来源及培养 将本室保存的HpY06、SS1(sydneystrain1)菌株涂布于Hp选择性平板培养基上,微需氧环境37℃培养5d,凡能在Hp选择性培养基上生长、针尖样透明菌落、革兰阴性细小弯曲杆菌、快速尿素酶试验阳性、氧化酶试验阳性、能与Hp全菌抗体发生凝集者鉴定为Hp。 大肠杆菌44815株购自中国药品生物制品检定所。将大肠杆菌44815株接种于LB琼脂平板上,37℃培养24h。挑取单个菌落进行革兰染色镜检,若是革兰阴性、中等大小杆菌者,再次转种培养。 2.细菌基因组DNA的制备 采用常规的苯酚—氯仿法提取HpY06株和大肠杆菌44815株培养物的基因组DNA,经无DNA酶的RNA酶消化后,再用苯酚—氯仿法将提取的DNA溶于TE缓冲液中作为PCR的模板,用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。 3.hpaA基因和ltB基因的扩增 根据报道的hpaA和ltB的基因序列设计引物,采用PCR扩增hpaA和ltB全基因序列,溴乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 4.hpaA和ltB基因T-A克隆和核苷酸序列测定 采用上海申能博彩生物科技有限公司(SNBC)的3SPCRProductPurificationKitV2.0回收目的扩增片段。目的扩增片段连接于pUCm-T载体中,形成用于测序的pUCm-T-hpaA、pUCm-T-ltB重组质粒。转化至E.coliDH5α中,经蓝白筛选的阳性克隆扩增后用碱变性法提取重组质粒,双酶切鉴定后用双脱氧链末端终止法测定插入片段的核苷酸序列。所获得的序列与GeneBank登录的hpaA基因和ltB基因序列进行核苷酸同源性比较。 5.ltB-hpaA融合基因的构建 扩增含pUCm-T-ltB和pUCm-T-hpaA的E.coliDH5α,碱变性法提取质粒,经无DNA酶的RNA酶消化后,再用苯酚-氯仿法提取质粒。以pUCm-T-ltB质粒为模板,PCR扩增ltB全基因片段,ltB上游引物序列:5'-CCGGGATCCTGAATAAAGTAAATGTTA-3’(BamHⅠ)下游连接引物序列:5,-CTTTAAAATGATTATTTGCTCTGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3’,反应条件同上,采用凝胶回收试剂盒(BBST)回收目的片段。pUCm-T-hpaA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃双酶切2h,回收目的片段,紫外分光光度法测定其浓度。以总含量100ng、ltB∶hpaA≈2∶1两种DNA回收片段为模板,反应总体积为90μl,内含除引物外的PCR各试剂,反应参数:94℃5min,×1;94℃30sec,45℃30sec,72℃150sec,×10;72℃10min,×1,以便形成复合模板。然后加入浓度均为250nmol/L的上述ltB上游引物和hpaA下游引物5'-CCGAAGCTTTCGGTTTCTCTTGTTTTTC-3’(HindⅢ),反应参数:94℃3min,×1;94℃30S,50℃30S,72℃90S,×10;94℃30S,50℃30S,72℃180S(以后每循环增加15S),×15;72℃10min,×1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,目的扩增产物的预期大小为1177bp。 6.ltB-hpaA融合基因T-A克隆、亚克隆和核苷酸序列测定 按上法将ltB-hpaA片段克隆、转化、扩增、提取质粒。测序对比序列后,将重组质粒及pQE32双酶切后获得的目的片段进行连接,转化于E.coliM15,获得工程菌pQE32-ltB-hpaA-M15。然后扩增、提取质粒后再次测序。 7.目的重组蛋白表达和纯化 重组表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15分别在含1.0、0.5和0.1mmol/LIPTG的LB培养基中37℃震荡培养,其中1.0mmol/LIPTG诱导产物经超声波破碎、5000r/min离心5min后分为上清和沉淀,采用SDS-PAGE检查重组蛋白(rLTB-HpaA)的分子量、表达产量和存在形式。采用Ni-NTA亲和层析法提纯上述重组蛋白。 8.rLTB-hpaA免疫原性、免疫反应性和佐剂活性的鉴定 以兔抗Hp全菌抗体为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,用westernbolt检测rLTB-HpaA的免疫反应性。NTA亲和层析法(BBST)收集的rLTB-HpaA免疫家兔,用westernbolt检测rLTB-HpaA的抗原性。 用牛GM1(Sigma)包被酶标板,洗涤后分别加入每孔4μg的rLTB-HpaA,重复4孔。以兔抗rLTB-HpaA血清为一抗、HRP标记羊抗兔IgG为二抗、OPT为底物,显色后检测OD490吸光值。实验中以等量BSA代替rLTB-HpaA作为阴性对照。以阴性对照平均吸光值+3SD为阳性。 9.小鼠保护试验 将BALB/c小鼠分组,每组12只。各组分别命名为实验组(rHpaA)、实验组(rLTB-HpaA)、感染对照组和正常对照组。将rHpaA和rLTB-HpaA分别溶于pH7.4、0.01mol/LPBS中。各试验组小鼠分别用rHpaA、rLTB-HpaA进行口服(灌喂)免疫,末次免疫后第28、30、32d三次灌喂5×1010CFU/ml的HpSS1株悬液200μl。末次感染4周后处死各组小鼠,取胃窦组织标本匀浆后接种于选择性哥伦比亚血琼脂平板,微需氧条件下37℃培养5-7d,Hp鉴定方法同前。10.ELISA 用浓度为20μg/mlrLTB-HpaA融合蛋白包被酶标板,分别以1∶200稀释的患者血清为一抗、HRP标记的羊抗人IgG为二抗、邻苯二胺为底物,用ELISA来检测126例Hp感染者血清中HpaA抗体存在情况。显色后用酶联免疫检测仪检测490nm的吸光值,超过6份阴性血清平均吸光值+3SD者为阳性。 结果1.PCR ltB、hpaA、ltB-hpaA的PCR扩增片段的大小分别约为375bp、802bp和1177bp。 2.核苷酸和氨基酸序列分析 与GenBank登录的基因序列比较,所克隆的hpaA和ltB核苷酸序列相似性分别为94.25%~97.32%和99.12%~99.71%,氨基酸序列相似性为95.38%~98.46%和97.58%~99.19%。ltB-hpaA融合基因序列与ltB、hpaA基因序列完全相同。 3.表达载体的鉴定 pQE32-ltB-hpaA经双酶切和琼脂糖凝胶电泳后,在预期位置上可见目的条带;核苷酸序列测定结果证实了插入的目的基因序列和方向正确。 4.目的:蛋白的表达 SDS-PAGE结果表明,IPTG能较好地诱导目的蛋白rLTB-HpaA的表达,产量约占全菌蛋白的30%,但主要以包涵体形式存在。 5.rLTB-hpaA的免疫原性、免疫反应性和佐剂活性。 Westernbolt证实:兔抗Hp全菌抗体和NTA亲和层析法收集的rLTB-HpaA免疫家兔后产生的抗体均能与rLTB-HpaA结合。 anti-rLTB-HpaA血清1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释度时,rLTB-HpaA阳性判断标准值分别为0.68、0.52、0.55和0.19,rLTB-HpaA试验组OD490值分别为1.64、1.55、1.52、1.10,表明rLTB-HpaA能与牛GM1结合。 6.小鼠保护试验 rHpaA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,而rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%。 7.ELISA结果 6例阴性血清的OD490均值±SD为0.11±0.03,阳性标准为0.20;81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,其OD490值范围0.54~1.84。 6例细菌阴性对照的OD490均值±SD为0.04±0.04,阳性标准为0.16;41株Hp的HpaA检测结果均阳性,其OD490值范围0.52~1.47。 结论:1.本研究成功地构建了ltB-hpaA融合基因高效原核表达系统。 2.表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用。
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