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能量可控陡脉冲对肿瘤细胞膜功能的影响及安全性研究
中文名称: 能量可控陡脉冲对肿瘤细胞膜功能的影响及安全性研究
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论文编号: 3122241收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Effects of Energy Controllable Steep Pulse on the Cell Membrane and Its Safety
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 妇产科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 能量可控陡脉冲 Ca~(2+)浓度 膜电位 细胞缝隙连接 Western blot analysis RT-PCR VX_2肿瘤 治疗剂量 安全性 陡脉冲电场
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论文简介:陡脉冲电场对细胞膜的不可逆性电击穿导致的细胞死亡成为了恶性肿瘤低创或微创物理治癌的新方式,而其对机体的安全性以及对周边正常组织有否影响是保证其安全治疗的前提。细胞膜作为生物膜在维持细胞稳定性中具有重要的作用。细胞膜电位是作为细胞膜最重要的生物物理特性之一,它在细胞的正常生命活动中亦起着重要的作用,调节着许多重要的细胞功能。膜电位的变化必然会改变细胞膜离子通道状态,导致细胞内离子浓度变化。而离子浓度的改变还可能影响细胞缝隙连接功能,影响肿瘤细胞的增殖和活性。因此本研究拟通过三个部分的研究进行陡脉冲对细胞膜功能的影响及其对机体的安全性作深入的探讨,对陡脉冲研制中某些关键问题作定性及定量的研究。 第一部分 能量可控陡脉冲对细胞内钙离子浓度及膜电位的影响 目的:探讨不同剂量陡脉冲对细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)和细胞膜电位的影响,为进一步研究其治疗恶性肿瘤的机制奠定基础。 方法:将乳腺癌细胞MDA-MB-231分为对照组和5个不同剂量ECSP处理组,分别用荧光探针Fluo-3/AM标记Ca2+、DiBAC4⒊标记细胞膜电位,应用激光共聚焦显微镜静态观察不同剂量ECSP处理后乳腺癌细胞内荧光探针的平均荧光强度,分析ECSP处理后乳腺癌细胞内Ca2+浓度的变化以及细胞膜电位的改变。应用激光共聚焦显微镜分别动态实时观察细胞外有钙离子和无钙离子时,ECSP对细胞内游离Ca2+浓度的影响。 结果:静态观察发现在细胞受到电场刺激后,细胞内[Ca2+]i随电场强度不同而不同。在能量较低时细胞内Ca2+平均荧光强度增加,细胞外钙内流。在能量增大后,细胞内Ca2+平均荧光强度逐渐减小,细胞内钙大量外流。实时动态观察发现在低能量的脉冲处理时,细胞内Ca2+浓度的荧光强度随着脉冲电场强度的升高而增加;其上升速率也随着脉冲电场强度的升高而加快,但是当脉冲能量升高到一定程度时其荧光强度逐渐下降。当能量达到电压280V,频率100Hz时,呈现明显的下降。在没有外Ca2+的情况下,细胞内的Ca2+浓度的增加虽然与有外钙的电激液相比显著下降;但是在脉冲电场作用下,细胞内游离Ca2+浓度仍缓慢上升。低剂量的ECSP作用可诱导细胞DiBAC4⒊的荧光强度增强,且随作用剂量的增加此作用越明显,表明低剂量ECSP能促进细胞膜电位负值减小,诱导细胞发生去极化。但当剂量继续增加时,则该作用发生明显改变,表现为诱导细胞DiBAC4⒊的荧光强度减弱,表明该剂量ECSP能促进细胞膜电位负值增大,诱导细胞发生超极化。 结论:低能量陡脉冲可使细胞膜发生去极化,诱导细胞外钙离子内流,使肿瘤细胞发生调亡;高能量陡脉冲可直接破坏细胞膜,使细胞膜发生超极化,诱导细胞内钙离子外流,使肿瘤细胞发生坏死。 第二部分 能量可控陡脉冲对细胞缝隙连接的影响 目的:研究能量可控陡脉冲对细胞缝隙连接蛋白Cx43的影响,为进一步探讨其对恶性肿瘤细胞功能的影响打下基础。 方法:处理组用不同剂量参数组合的陡脉冲对培养的乳腺癌MDA-MB-23l细胞处理5min后继续培养48小时。对照组不予任何处理。两组均采用间接免疫荧光细胞化学法和激光共聚焦显微镜进行连接蛋白Cx43定位的测定。分别采用Westernblot方法检测细胞内Cx43蛋白的含量,RT-PCR检测Cx43mRNA的表达。 结果:对照组乳腺癌细胞间连接处有散在的明亮点状标记;经电压100V,频率100Hz;电压100V,频率200Hz;电压150V,频率100Hz(ECSP处理2、3、4组)的ECSP处理后继续培养的乳腺癌细胞间连接处标记斑点较对照组增多。Westernblot分析表明:ECSP处理2、3、4组Cx43蛋白条带亮度明显增加,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05)。RT-PCR扩增产物中,ECSP处理2、3、4组Cx43基因条带亮度明显亮于乳腺癌对照组(P<0.05),与乳腺癌细胞组比较差异有显著性。电压100V,频率50Hz和电压200V,频率200Hz(ECSP处理1、5组)ECSP处理后继续培养的乳腺癌细胞间连接处标记斑点与对照组无明显差异。ECSP处理1、5组Cx43蛋白条带与对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。RT-PCR扩增产物中,ECSP处理1、5组Cx43基因条带亮度与乳腺癌对照组比较差异无显著性(P>0.05)。 结论:低能量陡脉冲(电压100V,频率100Hz;电压100V,频率200Hz;电压150V,频率100Hz)可增强体外培养的乳腺癌细胞GJIC功能,从而达到治疗恶性肿瘤的目的。 第三部分能量 可控陡脉冲治疗兔移植性肿瘤的安全性探讨 目的:研究能量可控陡脉冲治疗兔移植性肿瘤的最佳剂量及其安全性。 方法:建立30只新西兰大白兔VX2移植性乳腺癌模型,通过正交设计给予ECSP处理,TTC染色观察其处理后坏死体积情况,通过直观分析寻找最佳剂量。在最佳剂量下,给20只新西兰大白兔VX2移植性乳腺癌模型ECSP处理,比较其处理前和处理后1、7天的呼吸、心律、肝功、肾功、血图和心电图(ECG)的变化。同时建立20只新西兰大白兔VX2移植性肝癌模型,给予ECSP处理后取其周边正常组织,行DNA片断化分析及彗星实验。 结果:在ECSP的4个参数中,电压对治疗效果的影响最大。在不考虑各因素间相互影响的条件下,电压为150V,频率为100Hz,脉宽为0.01μm,作用时间为15min时对兔乳腺癌移植瘤的治疗效果最理想。在最佳治疗剂量下,经ECSP处理后动物的心律、呼吸、肝功、肾功、血图和ECG与处理前比较,差异无显著性(P>0.05)。ECSP处理后对周边正常组织的DNA电泳为一完整条带,无明显彗星扫尾现象发生,表明无DNA损伤。 结论:ECSP处理兔移植性肿瘤的最佳剂量为:电压150V,频率100Hz,脉宽0.0lμm,作用时间15min,ECSP处理对兔全身和周围组织安全。
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