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能量可控陡脉冲对肿瘤血管和免疫功能影响的实验研究
中文名称: 能量可控陡脉冲对肿瘤血管和免疫功能影响的实验研究
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论文编号: 3122240收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Experimental Studies of Tumor Blood Vessel and Immune Function by Energy Controllable Steep Pulse
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 妇产科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 陡脉冲/电疗法 肿瘤细胞/体外培养 血管内皮生长因子 卵巢癌细胞 信号通路 内皮细胞/体外培养 肿瘤血管 肿瘤/电疗法 VEGF 细胞凋亡 淋巴细胞 NK细胞 巨噬细胞 免疫功能 Th1/Th2
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论文简介:电化学疗法是一种利用局部电脉冲刺激和化学抗癌药物相结合治疗肿瘤的新方法,目前已广泛运用于头颈部肿瘤、黑色素瘤、基底细胞癌等肿瘤的临床治疗。本课题组前期试验已经证实,能量可控陡脉冲(EnergyControllableSteepPulse,ECSP)作为一种物理治疗方法可导致肿瘤细胞核固缩、核碎裂及核溶解,肿瘤血管内血栓形成,同时发现ECSP可明显改善荷瘤小鼠的生存状况,延长其生存期,对肿瘤具有明显的杀伤和抑制效应。血管转移是肿瘤转移的重要途径,如果在杀伤肿瘤细胞的同时也能破坏靶区内的营养血管,则可以有效减少治疗后局部残留并存活的肿瘤细胞通过血管途径转移到其他部位的可能性。而且肿瘤的发生、发展和转移都与机体的免疫功能状态密切相关,改善和恢复机体的免疫功能,能有效地抑制肿瘤的生长和转移。 随着对能量可控陡脉冲治癌研究的深入,其治癌机理已渐被揭示:主要是陡脉冲致肿瘤细胞的不可逆电击穿,诱导肿瘤细胞凋亡,但能量可控陡脉冲的电穿孔有着复杂的生物学效应,而且对肿瘤边缘残存的有活性的肿瘤细胞的杀伤和处理是影响陡脉冲治疗效果的关键,本课题通过能量可控陡脉冲对体外和在体恶性肿瘤模型进行治疗,进一步深入了解其治癌机制,探讨能量可控陡脉冲对肿瘤血管及肿瘤机体免疫功能的影响,为癌症的陡脉冲治疗提供理论和临床试验依据。 第一章能量可控陡脉冲抗肿瘤lla管的实验研究 第一节能量可控陡脉冲对体外培养的人卵巢癌细胞分泌功能的影响 目的:进一步探讨能量可控陡脉冲对人卵巢癌细胞株SKOV3的作用,了解肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子的变化及信号调节通路的改变情况,并探讨其可能的作用机制。 方法:ECSP处理后24h,72h,获取肿瘤细胞培养上清液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中血管内皮生长因子VEGF的含量,逆转录一聚合酶联反应(RT-PCR)检测VEGFmRNA的表达,免疫印迹技术检测P13K/AKT信号通路中AKT及磷酸化的AKT的表达情况,流式细胞技术分析ECSP作用前后细胞凋亡的情况。 结果:⒈能量可控陡脉冲处理后,肿瘤细胞分泌的VEGF蛋白含量减少,且随时间的延长,与对照组间的差异越明显;⒉能量可控陡脉冲处理后,肿瘤细胞内VEGFmRNA的表达减少;⒊AKT及磷酸化的AKT在处理前后差异无显著性意义;⒋流式细胞分析结果表明,随能量可控陡脉冲剂量的增加,细胞的死亡率增加,但无明显的凋亡现象发生。 结论:能量可控陡脉冲对肿瘤细胞分泌功能有一定的影响,可从蛋白和基因水平改变VEGF的分泌量。但ECSP对肿瘤细胞的影响并不是通过P13K/AKT途径,可能存在其他的调节机制。 第二节能量可控陡脉冲对体外培养的人脐静脉内皮细胞生物学性状的影响 目的:研究不同剂量的能量可控陡脉冲对体外培养的人脐静脉内皮细胞生物学性状的影响,为进一步了解ECSP对肿瘤血管的影响提供依据。 方法:对人脐静脉内皮细胞HUVEC施以不同剂量的陡脉冲,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及细胞增殖曲线观察细胞的损伤效应,流式细胞技术分析作用前后细胞周期的情况。 结果:⒈MTT试验证明能量可控陡脉冲对人脐静脉内皮细胞的作用存在剂量效应关系,其杀伤率随剂量的增加而增加,揭示高剂量的ECSP可导致血管内皮细胞急性损伤效应;⒉细胞增殖曲线表明随ECSP剂量的增加,细胞增殖能力抑制越明显;⒊流式细胞分析结果表明,随能量可控陡脉冲剂量的增加,细胞周期变化不明显 。结论:能量可控陡脉冲不仅可通过不可逆电击穿直接杀死脐静脉内皮细胞,造成血管损伤,还可抑制细胞增殖活性。因此ECSP除了对肿瘤的杀伤效应以外,还可通过对血管内皮细胞的作用发挥抗肿瘤血管效应。 第三节能量可控陡脉冲对大鼠皮下移植瘤的杀伤作用及肿瘤内血管和凋亡的变化 目的:研究能量可控陡脉冲对荷瘤大鼠移植瘤的影响,了解ECSP处理对在体肿瘤组织血管以及细胞程序化死亡的影响,进一步探讨ECSP治疗肿瘤的作用机制,为能量可控陡脉冲治疗恶性肿瘤的有效性提供理论依据。 方法:采用细胞悬液注射法建立Wistar大鼠皮下瘤模型,将其随机分为两组,荷瘤对照组和ECSP处理组,光、电镜观察肿瘤的形态学变化,并采用免疫组织化学技术检测肿瘤内微血管密度、血管内皮生长因子、凋亡相关蛋白的改变,原位末端标记技术检测细胞凋亡情况。 结果:⒈通过组织学检测证实:陡脉冲电场能直接杀死肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞的增殖,组织形态学改变于治疗后光电镜观察大量肿瘤组织坏死呈伊红染色,周边处有少量瘤细胞残存,肿瘤细胞出现核固缩、碎裂、溶解、坏死;⒉免疫组化结果显示ECSP处理组微血管明显减少,VEGF的表达明显减弱,且与对照组比较均具有显著性差异;⒊TUNEL检测可见处理组阳性细胞明显增多,与前期研究相符,Bcl-2/Bax发生改变,提示ECSP可通过Bcl-2/Bax途径诱导肿瘤细胞凋亡。 结论:能量可控陡脉冲对恶性肿瘤具有杀灭和抑制作用,并可导致肿瘤细胞分泌的VEGF减少,肿瘤微血管减少,引起肿瘤生长减慢,同时,ECSP可能通过Bcl-2/Bax调节途径来诱发肿瘤细胞凋亡的发生,从而达到治疗肿瘤的目的。 第二章能量.-7控陡脉冲对荷瘤鼠免疫功能影响的实验研究 第一节能量可控陡脉冲对荷瘤鼠淋巴细胞、NK细胞及巨噬细胞的影响 目的:观察能量可控陡脉冲对荷瘤大鼠淋巴细胞转化率、NK细胞活性和巨噬细胞分泌rNF-a的影响,探讨能量可控陡脉冲对荷瘤鼠细胞免疫功能的影响。 方法:建立Walker256皮下移植瘤模型并随机分为2组,另取正常健康成年大鼠作为正常对照,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察大鼠脾淋巴细胞转化率和NK细胞的活性,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹腔巨噬细胞上清液中TNF-(1,的含量。 结果:⒈ECSP处理组脾淋巴细胞转化反应较荷瘤对照组明显提高,两组大鼠脾淋巴细胞转化具有显著性意义,ECSP处理组与正常对照组比较无显著性差异,提示ECSP能明显增强大鼠脾淋巴细胞增殖反应;⒉ECSP处理明显增强荷瘤大鼠NK细胞的活性,与荷瘤对照组大鼠NK细胞活性相比有显著性差异,且与正常对照组比较无显著性差异,提示ECSP能明显增强大鼠NK细胞的活性;⒊ECSP处理组腹腔巨噬细胞分泌的TNF-(I的表达水平明显上升,高于荷瘤对照组,与正常对照组比较无显著性差异,提示ECSP能改善荷瘤机体巨噬细胞的功能,促进大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-(I。 结论:ECSP能够促进大鼠Mci)分泌TNF-u,,增加淋巴细胞的转化率,增强NK细胞的活性,提示ECSP能够通过增强机体的细胞免疫功能,达到治疗肿瘤的目的。 第二节能量可控陡脉冲对脾细胞分泌的细胞因-T-的影响 目的:观察能量可控陡脉冲处理后荷瘤大鼠脾细胞分泌的Thl/Th2类细胞因子的改变,探讨能量可控陡脉冲对肿瘤机体内Thl/Th2类细胞的影响。 方法:建立Walker256皮下移植瘤模型和正常对照组,ECSP处理后,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测淋巴细胞上清液中细胞因子IL-4、IFN-T的含量,逆转录一聚合酶联反应(RT-PCR)检测脾淋巴细胞中IL-4mRNA、IFN-TmRNA的表达。 结果:⒈ECSP能增强大鼠Th1型细胞因子即IFN-7的分泌,降低Th2型细胞因子即IL-4的分泌,从而促使机体从Th2向Thl逆转,有利于提高机体抗肿瘤免疫功能;⒉RT-PCR结果显示处理组与荷瘤对照组比较IFN-TmRNA的表达增强、IL-4mRNA的表达减弱,提示ECSP可从基因水平改变机体Thl/Th2类细胞因子的分泌。 结论:ECSP可能激活机体免疫,促使Th2向Thl逆转,达到抑制肿瘤生长、提高大鼠抗肿瘤免疫功能的作用。
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