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木芙蓉在肝病中的药理作用及机理研究
中文名称: 木芙蓉在肝病中的药理作用及机理研究
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论文编号: 3122235收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Pharmaceutical Effects of Cottonrose Hibiscus on Liver Disease and Study of Its Mechanism
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 木芙蓉 高效液相 芦丁 四氯化碳 大鼠 TLR_2和TLR_4 DC(树突状细胞) HepG 2.2.15 乙肝病毒DNA 肝癌细胞
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论文简介:黄酮类化合物具有多种生物活性,除具有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇痛和镇静等外,近年来研究发现还具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用,而木芙蓉的主要化学成分是黄酮类化合物,如槲皮甙(quercnrin)、异槲皮甙(isoqercnnn)、金丝桃甙(hyperoside)、绣线菊甙(piracoside)、花色甙、芦丁(芸香苷)、山奈酚-3-0-β-芸香糖苷、山奈酚-3-0-β-刺槐双糖苷及山奈酚-3-O-β-D-(6-E-对羟基桂皮酰基)-葡萄糖苷等。一些研究发现它具有高度的抗炎活性、抑菌活性以及对肾缺血再灌注损伤有保护作用,另外它在外用和口服中有很好的抗炎、消肿作用,可以治疗阑尾炎、腮腺炎,也可以治疗关节炎、丹毒等。陈文吟等研究发现木芙蓉叶提取液对2.2.15细胞表达HBsA、HBeAg均有抑制作用。作者利用木芙蓉提取液对大鼠肝炎模型、HepG2.2.15和HepG2细胞的作用,探讨了其在保肝、抗乙肝病毒及抑制肿瘤等方面的功能。现分别介绍如下。 第一部分HLPC法测定木芙蓉提取物中总黄酮含量 目的:木芙蓉属槿葵科木属植物,其主要成分为黄酮甙,包括槲皮甙(uercnnn)、异槲皮甙(isoqercnrin)、金丝桃甙(hyperoside)和绣线菊甙(piracoside),及花色甙等,为测定木芙蓉主要成分,本实验建立木芙蓉中总黄酮的含量测定方法。 方法:波长的选择,取标准溶液及样品提取液在RF一540检测器上进行扫描,发现在300~400nm间有最大吸收值,而本次实验选用370nm为检测波长。测定木芙蓉中黄酮的方法很多,而应用高效液相法检测则是第一次。色谱条件色谱条件:色谱柱C18;流动相:含l%冰醋酸的磷酸二氢钾一甲醇(73:27,V:V);流速:1.0ml/min:柱温:25℃检测器:SPD一2ASUV检测器;进样体积20μl,手动进样,灵敏度:AUFS=0.8;在上述色谱条件下,对照品溶液和样品溶液分别进样分析。根据高效液相法得到木芙蓉和芦丁色谱图结果;然后计算出木芙蓉中所含总黄酮的含量。 结论:黄酮类化合物是植物中一类多酚化合物,具有多种药理作用,如具有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇痛和镇静等外,还具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用。同样因木芙蓉主要成分是黄酮类物质,实验已经证明,其在外用和口服中有很好的抗炎、消肿作用,可以治疗阑尾炎、腮腺炎,也可以治疗关节炎、丹毒等。作者采用70%乙醇溶解木芙蓉叶,然后加热蒸发乙醇、用甲醇稀释,以1500O转/分离心,即得木芙蓉中的总黄酮,然后进行过滤在一20℃保存。回收率结果表明,本实验方法提取较完全,结果可靠。 第二部分木芙蓉对四氯化碳大鼠急性肝损伤的保护作用 目的:应用四氯化碳制备大鼠急性肝损伤模型,然后通过给大鼠灌胃来探讨木芙蓉预防和治疗急性肝损伤的作用情况。 方法:采用70%乙醇100ml溶解木芙蓉叶10g,之后蒸发乙醇、离心5min,用水稀释、过滤一20℃保存备用;实验分为治疗组、预防组和对照组,预防组事先给予大鼠木芙蓉溶液灌胃,而治疗组在大鼠腹腔注射含1%四氯化碳豆油后给予木芙蓉溶液灌胃,然后测定损伤大鼠血清谷丙氨酸转氨酶和谷草氨酸转氨酶的活性;取肝脏同一部位进行病理学检查,观察大鼠肝脏组织结构变化情况。 讨论:肝损伤常见于病毒性、化学中毒性(包括医源性和酒精性)、寄生虫性以及营养不良性引起的肝脏病理生理改变。目前尚无特效药物可以有效减轻肝脏损伤和促进肝细胞再生,寻求与开发新型的保肝和护肝产品引起人们的普遍关注,特别是近年来,许多学者专家把目光投向了我国传统的中医药学。现代科学研究已确认一些天然植物有一定的药用成分和保健作用。锦葵科木槿属植物,分布于热带和亚热带地区,而此属植物多数供药用,对治疗跌打、损伤、痢疾腹泻、心脏和神经系统等均有疗效,木芙蓉属槿葵科木属植物,据研究其在抗炎、消肿方面有很好的作用。作者研究发现木芙蓉能明显降低肝炎大鼠血清中的转氨酶,并且能够减轻肝脏中的病理变化,木芙蓉作为治疗肝炎的一种新药是值得推广的。 第三部分木芙蓉的免疫调节功能 目的:木芙蓉叶的主要成分是黄酮类化合物,实验研究,其能够增强机体内的非特异免疫功能和体液免疫功能,作者通过体内和体外实验观察来探讨木芙蓉对大鼠脾脏和人DC细胞免疫影响。 方法:实验分为对照组、中毒组和治疗组(与第二部分木芙蓉治疗急性肝损伤相同),治疗组用木芙蓉溶液给大鼠灌胃,中毒组和对照组则给予生理盐水灌胃,之后取大鼠脾脏分离巨噬细胞,提取细胞内的总RNA,采用砌RT-PCR法测定大鼠脾脏中巨噬细胞受体TLR2和TLR4的表达情况;取健康人体外周血分离单核细胞,然后在体外培养DC(树突状细胞)细胞,分别用细胞因子和不同浓度(1.2,12,120ug/m1)木芙蓉溶液处理,将培养的树突状细胞分为用药组和对照组,DC细胞和同种异体淋巴细胞按1:10混合比例进行混合,采用MTT和3H-TdR法测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖程度。 讨论:黄酮类化合物对动物免疫功能具有增加、抑制、双向调节等多方面作用,这可能是由于黄酮类化合物功能集团的差异造成其生理活性的不同。如大豆异黄酮、泡桶化黄酮等黄酮类化合物可诱导巨噬细胞增生,增强其活性作用,滕茶总黄酮可增强小鼠单核.巨噬细胞吞噬功能,而且可促进小鼠免疫器官发育,进而增强其特异性免疫功能。有实验报道,某些黄酮类化合物可抑制巨噬细胞吞噬等辅助细胞的抗原递呈功能,从而表现出一定的抗炎、抗过敏作用。木芙蓉中主要成分为黄酮类化合物,其花、叶和根均可入药,具有消肿排毒、止血之功用。作者通过体内、外实验研究发现木芙蓉有明显增强非特异性功能,如提高巨噬细胞受体TLR2和TLR4表达能力,并且对树突状细胞功能也有增强作用,其抗炎作用是否与此有关,其机理有待进一步证明。 第四部分木芙蓉抗病毒及与DNA的结合作用 目的:一些实验表明木芙蓉有明显抗炎作用,为探讨其抗病毒作用,作者通过体外实验木芙蓉作用于HepG2.2.15细胞,观察其对HBsAg和HBeAg分泌的影响及对HBV-DNA合成抑制作用。 方法:培养HepG2.2.15细胞,进行细胞毒实验,找出最大无毒药物浓度,然后加入不同浓度的木芙蓉溶液共同培养,采用EUSA法检测HBsAg和邶eAg分泌情况;裂解HepG2.2.15细胞,采用试剂盒提取细胞内DNA,用PCR方法检测用药前、后细胞内HBV-DNA的含量;提取质粒pCEP4和pEGFP-Cl,配制不同浓度的木芙蓉溶液,质粒与木芙蓉溶液进行结合,之后进行电泳,在成像仪下观察加药组与对照组电泳条带的情况。 讨论:有研究表明,抗病毒感染的单味中药,具有抑制病毒增殖或灭活,阻止病毒吸附细胞的作用。而且不少中药有的是直接抗病毒,有的是则借助免疫调节作用间接抗病毒作用,如黄芩中提取的黄酮类化合物,通过抑制病毒包涵体/溶酶体膜的融合,能减少流感病毒感染小鼠的病毒复制。当黄芩黄酮类加到流感病毒感染MDCK细胞时,能减少病毒的释放。新近研究发现,小贯叶金丝桃有抗包膜病毒的作用,对艾滋病、乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎,单纯庖疹、流感等病毒感染性疾病的治疗,具有一定的作用。近年研究发现木芙蓉叶外用、内服,均有抗炎作用,如治疗阑尾炎、腮腺炎、丹毒等,其机理可能是直接抑制病毒,或者是提高机体免疫功能而达到抗病毒作用。作者发现其具有明显的抑制乙肝病毒的作用,其机制有待进一步证明。 第五部分木芙蓉对人肝癌细胞№pG2细胞作用 目的:培养肝癌细胞,配制不同浓度的药物溶液,采用不同的实验方法和检测指标,观察木芙蓉溶液抑制人肝癌细胞株(HepG2)的生长、增殖的情况,探讨中药治肝癌的新途径。 方法:体外培养HepG2细胞,通过记数,调整细胞数,然后加入至96孔板中,并且分为对照组和加药组,用甲基塞唑基四唑(MTT)法、3H-TdR掺入法测定不同浓度木芙蓉对人肝癌HepG2的生长和增殖抑制率;同样培养细胞分别加入到24孔板和培养瓶中,采用荧光染色检测HepG2细胞凋亡影响,应用流式细胞仪检测细胞周期变化情况。 讨论;黄酮类化合物可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷、黄烷醇,其作用于抗肿瘤的研究由来很久。黄芩苷能强烈抑制3种肝癌细胞株拓扑异构酶2的活性,且能够抑制肝癌细胞株的增殖。而从银杏中提取的槲皮素等黄酮类能够抑制皮肤正常成纤维细胞生长。黄酮类化合物抗肿瘤的作用主要是通过诱导细胞凋亡、抗肿瘤细胞增殖、干预细胞信号传导、促进抑癌基因表达等途径来实现。可见利用黄酮类化合物诱导肿瘤细胞凋亡机制清除肿瘤细胞是肿瘤治疗的新观念、新手段。一些实验证实木芙蓉中的主要成分为黄酮类物质,作者研究发现药物组与对照组相比,木芙蓉在诱导肝癌细胞凋亡和抑制其生长方面具有非常明显的作用,且呈浓度和时间依赖性,其机制可能通过诱导肿瘤细胞凋亡,干预细胞凋亡信号传导途径,阻滞细胞周期,调节细胞因子等途径而实现的。
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