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Legumain基因DNA疫苗抗肝癌免疫研究
中文名称: Legumain基因DNA疫苗抗肝癌免疫研究
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论文编号: 3122227收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Immunotherapy Targeting for Hepato-Cellular Carcinoma with DNA Vaccine of Legumain Gene in Mice
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: Legumain 核酸疫苗 肝细胞癌 减毒沙门菌 DNA疫苗 肝癌 细胞凋亡
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论文简介:目的:由于原发性肝癌(HCC)存在突变、免疫逃避、抗原性弱、血供丰富等因素导致其死亡率、复发率较高,现有治疗方案并不能改善不能手术的患者的预后。近年来基因疫苗被运用在肿瘤的防治研究上,取得了较大进展,部分肿瘤基因疫苗已经进入临床试验阶段。Legumain为一种最新发现的类似天冬氨酸内肽酶的应激蛋白酶,其主要高表达在体内生长的肿瘤,以及肿瘤新生血管的内皮细胞和肿瘤基质内的TAMs中,在正常细胞不表达。因此,可做为一种有效的DNA疫苗抗原,充分诱导T细胞和体液免疫反应。本实验首先测定Legumain在肝癌荷瘤组织以及HepG2的表达,然后以C57BL/6J小鼠为研究对象,以Legumain作为HCC基因治疗靶抗原,构建融合DNA疫苗,以减毒沙门氏菌为DNA疫苗载体,以活菌免疫小鼠,观察其诱导的抗肿瘤效应及其免疫应答机制。 方法: 1.hLegumain在肝癌HepG2细胞和小鼠荷瘤组织中的表达,用免疫细胞化学及RT-PCR方法鉴定HepG2细胞的hLegumain表达。给鼠皮下注射HepG2细胞株,肿瘤组织在肿瘤细胞接种10~14天后收获并做免疫组化分析。 2.以减毒沙门菌为载体的mLegumainDNA疫苗在小鼠体内的分布和表达:将pCMV-Ub-Legumain真核表达质粒转染COS-7细胞,考查质粒在真核细胞中的表达;电转化减毒沙门菌RE88,构建重组活菌苗,用含EGFPl×108鼠沙门氏菌强饲小鼠,考查活菌苗在组织中的表达。 3.LegumainDNA疫苗的抗肿瘤免疫机制的研究:C57BL/6J小鼠以PBS、pCMV、pUb-Legumain预先口服免疫,每周一次,连续三周,3周后接种野生型亲本细胞Hepal—6,测量肿瘤大小、观察小鼠存活情况,观察成瘤情况以及肿瘤肺转移,评价重组DNA疫苗抗肝癌作用。用标准4h51Cr释放实验检测特异性CTL活性;用ELISA法检测细胞因子IFN-y的分泌情况;ELISA检测肿瘤组织细胞培养上清液和血清中TNF-(I、VEGF、TGF-p的表达。以细胞侵袭实验检测LegumainDNA疫苗对肝癌hepal一6细胞的侵袭力和转移影响。 结果: 1.免疫组化证实了Legumain在肝癌组织的表达,在未刺激的HepG2细胞检测不到Legumian的表达,经Rapamycin刺激后可以看到Legumian表达,提示Legumian的表达的确是应激表达,Legumian是一种应激反应蛋白。RT-PCR在200bp左右扩增出明显的DNA带,与hLegumain的编码基因大小一致,在mRNA水平证实了HepG2细胞表达Legumain。 2.以Emptyvector和pUb-legumainCOS一7细胞做SDS-PAGE未见明显差别,WesternBlot以化学发光法显色pUb-legumainCOS-7细胞裂解液可见Legumain蛋白的表达。用含pCMV-Ub-Legumain的5×108减毒RE88沙门氏菌强饲小鼠,结果发现RE88可转运目的基因到淋巴滤泡Peryer's结,激光共聚焦结果显示LegumainDNA疫苗被成功地转运到树突状细胞,表明RE88是有效的DNA疫苗转运载体。 3.C57BL/6J小鼠pUb-Legumain预先口服免疫,3周后接种野生型亲本细胞Hepal一6,PBS组和EmptyVector组30天全部死亡,而pUb-Legumain组有5只到60天继续存活(62%),小鼠生存期延长,肿瘤出现时间延迟,肿瘤体积缩小,诱导了对肝癌生长明显的抑制。相反,用PBS或仅编码pUb并由减毒鼠伤寒沙门氏菌转运的空载体免疫的所有动物出现原发肿瘤的快速生长和广泛转移。 4.标准4h51Cr释放实验中,在效/靶比为l00:1,50:l时,pUb-Legumain与EmptyVector分别为43.57+0.04、36.41+0.03、24.16+0.05、l7.43+0.03,pUb-Legumain组CTL活性明显增强(p<0.01),能特异性地杀伤肿瘤细胞。pUb-Legumain与EmptyVectorlFN-7分泌量为410.218~64.727pg/ml、46.698~26.757pg/ml,pUb-Legumain组IFN-7分泌量高于EmptyVector组(P<0.01)。 5.从LegumainDNA疫苗免疫小鼠分离血清和肿瘤组织细胞,ELISA检测发现在肿瘤组织上清液和血清中rmF-~和VEGF均显著减少,免疫组化染色也证实了这些细胞因子表达的下降。我们的初步结果表明清除肿瘤微环境中TAMs有助于减少肿瘤生长因子、促血管生成因子和MMP9的释放。 6.细胞侵袭实验,将0.5mlPBS、EmptyVector、pUB-legumain的Hepal一6细胞悬液(2x105个细胞)加入BoydenChamber上室,48h后观察,结果发现,pUb-legumain组实验细胞的侵袭数(45士5)明显减少,与Hepal一6细胞(71士4)和EmptyVector组细胞(80土4),差异有统计学意义(P<0.01)。以体外实验证实了LegumainDNA疫苗可以抑制细胞的侵袭力和转移。 结论: 以Legumain全基因制备鼠肝癌DNA疫苗,通过减毒沙门氏菌载体口服转运,诱导细胞介导和体液免疫反应,有效抑制肿瘤的生长,对肿瘤的攻击具有较强的免疫保护作用,同时抑制自发转移灶的扩散以及特异杀伤肿瘤细胞和TAMs,可破坏肿瘤基质中的TAMs,导致血管生成抑制,并诱导肿瘤细胞凋亡。提示LegumainDNA疫苗可以诱导体内特异性和非特异性免疫应答,有可能作为一种有效的瘤苗用于肝癌的生物治疗。
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