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食管癌人源噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选
中文名称: 食管癌人源噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选
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论文编号: 3122225收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Construction and Preliminary Screening of Human Phage Single-Chain Antibody Library Associtated with Esophageal Cancer
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 药理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 食管癌 抗体 基因工程 单链抗体 噬菌体 生物治疗 食管癌细胞
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论文简介:食管癌(esophagealcancer)是人类常见的一种消化道肿瘤,分别占我国和世界恶性肿瘤发病的第四位和第七位。世界上70%的食管癌发生在我国,我国是世界上食管癌死亡率最高的国家之一。食管癌患者的五年生存率始终徘徊在10%左右,仍然严重威胁着人民的生命和健康。食管癌的治疗以外科根治性手术为主,但对于手术不能切除的晚期肿瘤和转移复发的肿瘤临床尚无有效的治疗手段,而肿瘤的导向治疗可以达到特异地杀伤癌细胞,并尽可能降低对正常细胞的毒副作用,提高抗肿瘤的疗效。近10余年来,肿瘤的生物治疗已作为一种重要的治疗模式被广泛研究和应用于临床。抗体介导的肿瘤免疫显像和免疫治疗是生物治疗的重要组成部分,对肿瘤及其转移的诊断、精确的分期和治疗方案的确定均有重要意义。 自1975年Kohler和Milstein成功的制备第一株单克隆抗体以来,单抗的研究经历了鼠源性抗体人源化改造、小分子抗体和抗体展示文库三个研究阶段。其中抗体文库的出现将基因工程抗体的发展推向了高潮。 针对鼠源性单克隆抗体在临床应用中经常发生的异源性问题和导向治疗中大分子抗体存在的穿透力较差的问题,我们尝试应用噬菌体抗体库技术构建食管癌相关的人源单链抗体文库,并用食管癌细胞对抗体文库进行了初步筛选。 目的:用基因工程方法和噬菌体抗体库技术构建人源食管癌单链抗体库,并从中筛选出特异性的单链抗体,为食管癌的免疫诊断及免疫治疗提供新载体。 方法与结果: 噬菌体抗体文库的构建:L人源单链抗体基因文库的构建:取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取淋巴结的总RNA。设计简并引物,用RT一PCR的方法分别扩增抗体重链和轻链可变区基因eDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片断的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片断,再以VH和VL基因片断为模板分别扩增VH—linker与VL-1inker,然后用SOE—PCR技术将它们拼接后引入酶切位点SfiI和Not工,胶回收PCR产物即得到ScFv基因。结果显示:食管癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带;扩增VH的引物对为HuJH3FOR与HuVN5aBACK;扩增VL的引物对为HuVK5aBACK与HuJK2FOR;扩增VH-1inker的引物对为HuJH4-5Linker与HuVN5aBACK,扩增VL—linker的引物对为HuJK2FOR与Linker-HuVK2-3-6BACK;引入酶切位点的引物为HuJK2FORNot与HuVH5aBACKSfi。Vn基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的ScFv基因约为850bp。2.单链抗体基因文库与噬菌体载体pCANTAB-5E的拼接:制备转化效率达到108cfu/ugpUCl8DNA的高浓度电转菌TGi。单链抗体PCR产物经SfiI和NotI双酶切后,胶纯化回收。酶切产物与噬菌粒载体pCANTAB-5E连接反应后,电转化大肠杆菌TGi,结果获得2×10?cfu/ug氨苄青霉素抗性克隆。随机进行酶切反应鉴定,阳性插入率为9L7%(22/24)。随机测序结果证实抗体重链和轻链以整码的单链抗体方式准确插入了载体。3.噬菌体抗体的展示:用2一YT染,在无糖环境下诱导单链抗体片段的噬菌体展示。重组噬菌体的滴度达到10¨cfu/ml。 对噬菌体抗体库进行初步的筛选及鉴定:L食管癌细胞株对抗体库的富集:先以悬浮状态的正常人食管上皮细胞筛选后再用食管癌细胞Eca1.00和噬菌体抗体库进行了亲和富集,对4轮富集后的噬菌体抗体随机进行了ELISA检测,结果显示:30/85的克隆呈阳性反应。第一轮噬菌体收获率%为1.15×10一,第四轮噬菌体收获率%为1.62×10~,第四轮噬菌体收获率是第一轮的141倍。2.表达可溶性ScFv抗体:强阳性重组噬菌体克隆感染E.coliHB2151,经lmmIPTG诱导表达可溶性ScFv抗体。3.亲和柱层析纯化可溶性抗体:将上述可溶性抗体过HiTrapTMAnti—ETag柱进行亲和柱层析,先用中性缓冲洗去未结合抗体,再用酸性缓冲洗脱结合的目的抗体并用碱性缓冲中和,用Azs。检测,合并峰值高的溶液,进行蛋白定量。4.SDS—PAGE:用12%的分离胶及5%浓缩胶的SDS—PAGE测定上述纯化的可溶性抗体分子量的大小,结果显示分子量为30KD左右。5.Western-blot:免疫印迹实验表明HRP/anti-Mi3单克隆抗体能使一条分子量为30KD左右的条带染色。6.免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织,而其它癌组织不染色。7.免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使食管癌细胞Ecal09染色。8.用细胞ELISA测定可溶性抗体的免疫活性:Eca1.00~osnm为0.73_+0.n,胃癌BGc-823的为0.23+0.08,正常食管上皮细胞(NHEEC)为0.254-0.06,结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与Eca1.00细胞结合,而不与胃癌BGc-823和NHEEC结合。结论:针对鼠源性单克隆抗体在临床应用中经常发生的异源性问题,我们尝试应用噬菌体抗体库技术构建食管癌相关的人源单链抗体文库,并用食管癌细胞抗原对抗体文库进行了初步筛选。结果表明通过噬菌体抗体库技术可以直接从肿瘤病人癌周转移淋巴结中获得肿瘤相关的完全人源的片段。
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