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人Notch4基因转录调控的研究
中文名称: 人Notch4基因转录调控的研究
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论文编号: 3122224收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on Regulation of Human Notch4 Gene Transcription
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 药理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: Notch4基因表达 全反式视黄酸 三氧化二砷 增殖 造血干/祖细胞 重组质粒
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:目的:研究药物和细胞因子对人Notch4信号通路基因表达及其转录调控的影响,为干预Notch4基因在细胞增殖分化中的作用开拓新的分子药理学途径。 方法:采用实时定量PCR方法分析Notch4基因在不同细胞系的表达谱,筛选影响HUVEC和HL-60细胞Notch4基因表达的几种药物和细胞因子。采用MTT法、流式细胞仪、实时定量PCR和Westernbolt等分析细胞学和分子生物学技术,观察全反式视黄酸falltransretinoicacid,ATRA)和三氧化二砷(ArsenicTrioxide,As)对人早幼粒细胞白血病HL-60细胞增殖、分化和Notch4、Notchl信号通路基因表达的影响。利用PCR技术扩增人脐带血CD34+造血干/祖细胞Notch4启动子,采用基因重组技术构建Notch4启动子绿色荧光蛋白报告基因系统,用流式细胞仪和倒置荧光显微镜观测重组质粒在细胞系的表达规律。 结果:⑴Notch4、Jaggedl和Delta4在HUVEC、MCF.10、HK-2、MT-/.、MT-/-CdR、MT-/-CdRev细胞中表达较高,而在HacaT、HacaT-As、HL-60、RWPE—l、RWPE-As和RWPE-Cd细胞中则表达较低。⑵1μM氢化可的松(Hydrocortisone,Hyd)明显增加HUVEC细胞Notch4mRNA相对定量的百分率(P<0.05),500pg/ml肿瘤坏死因子一a(tumornecrosisfactor—alpha,TNF-(I)减少Notch4mRNA的相对定量的百分率;DNP、JSK、组胺(histamine,His)、As和转化生长因子一p(transforminggrowthfactor-p,TGF-p)对HUVEC和HL-60细胞Notch4mRNA的相对定量无明显改变。⑻O.1μM-lμMATRA和0.3gM一3μMAs剂量依赖性抑制HL-60细胞的增殖,高浓度的ATRA和As明显增加HL-60细胞中表达CD¨b细胞的阳性率。⑷1μMATRA上调Notch4,Notchl和DeltalmRNA表达,下调Jaggedl和HESl基因的表达。lOμMAs明显降低HESlmRNA表达,对Notch4和Notchl信号通路的其他基因mRNA无明显影响;1μMATRA增加Notch4蛋白的表达,降低jaggedl蛋白的表达。⑸所构建的hCD34+HSPCNotch4启动子全长和不同区域驱动的报告基因载体pEGFP3940和pEGFPl500、pEGFPl300、pEGFP800、pEGFPl30,经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序鉴定,与预期目标条带大小和DNA序列一致。⑹pEGFP3940载体转染HacaT细胞和HL-60细胞的转染效率分别为14.4%和3.2%,72hs一96hs为GFP表达高峰。⑺4种重组质粒转染HacaT细胞72hs,GFP表达强度依次为pEGFPl564>pEGFP3940、pEGFPl300和pEGFP800,而转染pEGFPl30的HacaT细胞中无明显的GFP表达。 结论:⑴在不同细胞系中,Notch4mRNA表达存在差异。⑵Hyd和TNF-~可能参与HUVEC的Notch4mRNA表达。⑶ATRA对HL-60细胞的增抑制殖和诱导向粒细胞分化作用可能与其调节Notchl和Notch4信号通路基因表达有关,提示在人Notch4基因的转录调控中,可能存在视黄酸(retinoicacid,RA)——Notch4通路。⑷人Notch4基因启动子不同区域驱动的报告基因载体存在不同转录活性,可能与Inrl、Inr2、RAREs、APl等顺式调控元件存在于不同区域有关。这些具有转录功能的重组质粒是进一步研究Notch4转录调控的实用性工具。
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