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人白细胞弹性蛋白酶抑制因子elafin的克隆、表达载体构建及对气道黏蛋白分泌的影响
中文名称: 人白细胞弹性蛋白酶抑制因子elafin的克隆、表达载体构建及对气道黏蛋白分泌的影响
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论文编号: 3122221收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: 无英文名称
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: Elafin 腺病毒 上皮细胞 气道 弹性蛋白酶 肿瘤坏死因子转换酶 活性氧 黏蛋白 信号传递
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论文简介:第一部分 人白细胞弹性蛋白酶抑制因子elafm的克隆及重组腺病毒表达载体的构建、鉴定与表达 目的:克隆人白细胞弹性蛋白酶(NE)抑制因子elafin基因eDNA,应用最新的腺病毒载体构建系统AdEasySystem构建含elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin,为进一步应用其进行气道上皮细胞黏蛋白(MUC)分泌调控的研究打下基础。 方法:⒈抽提人肺总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的基因片段,elafin目的片段经纯化双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy一1行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,PacI酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得腺病毒载体Ad-elafin,继之在293细胞内扩增,利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率,Western-blot检测elafin蛋白的表达。 结果:⒈经RT-PCR获得377bp的产物,经酶切、DNA测序,确定所扩增片段为人elafin基因cDNA。⒉质粒经酶切及PCR鉴定证实elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功,Western-blot检测到elafin蛋白的表达。 结论:获得编码elafin的基因片段,并成功构建了腺病毒表达载体Ad-elafin,为进一步研究elafin对气道上皮细胞MUC分泌的调控奠定了技术基础。 第二部分 Elaf'm重组腺病毒表达载体在气道上皮细胞中的表达目的研究重组腺病毒Ad-elafin表达载体转染气道上皮细胞的特性,观察其在上皮细胞中的表达时相动力学规律。 方法:⒈应用原代培养技术培养人气道上皮细胞;⒉重组腺病毒Ad-elafin表达载体转染气道上皮细胞;⒊在转染后不同的时相中,采用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,ELISA法检测细胞上清液elafin蛋白的表达,Northem膜杂交检测elafin基因mRNA的表达量。 结果:⒈原代培养人气道上皮细胞约5天,即可作为靶细胞。⒉转染Ad-elafin24h后,荧光显微镜下可见上皮细胞内有少量的GFP表达,随着时间的延长,细胞内荧光逐渐增加,96h后GFP荧光阳性的细胞约为80%。⒊转染24-96h后,实验组细胞上清液elafin的含量高于对照组(P<0.05);同时实验组elafin基因mRNA的表达量也高于对照组(P<0.05)。 结论重组腺病毒Ad-elafin表达载体可成功转染人气道上皮细胞,目的基因不仅在上皮细胞中表达,而且其elafin蛋白质具有细胞外分泌作用。 第三部分 弹性蛋白酶诱导气道上皮细胞黏蛋白分泌作用及其信号转导机制 目的通过弹性蛋白酶(NE)诱导气道上皮细胞黏蛋白(MUC)分泌和MUC5ACmRNA表达,探讨NE诱导气道上皮细胞MUC的分泌特性,同时研究NE通过表皮生长因子受体(EGFR)引起黏液高分泌的上游信号通路及下游信号在MAPK亚族中的传递途径。 方法:⒈应用原代培养技术培养人气道上皮细胞;⒉浓度为1um/L的NE与气道上皮细胞孵育后在不同时相中(1、3、6、12、24、32h),应用ELISA法检测细胞上清液中MUC及MUC5AC;细胞有形成分抽提RNA,RT-PCR检测MUC5ACmRNA水平;⒊不同的NE浓度(0.25、0.5、1.O、2.0、4.0um/L)与上皮细胞孵育后,同样采用ELISA法检测细胞上清液中MUC及MUC5AC的含量,细胞有形成分抽提RNA,应用RT-PCR检测MUC5ACmRNA表达;⒋给予NE刺激,以肿瘤坏死因子转换酶(TNF-igconvertingenzyme,TACE)抑制剂TAPI.1及活性氧(ROS)清除剂DMTU为干预因素。RT-PCR检测干预前后细胞中MUC5ACmRNA含量;ELISA检测培养上清中MUC5AC、可溶性转化生长因子(TGF)一α蛋白含量,Westernblot检测磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)蛋白水平。TPK信号通路中的MAPK三个亚族ERK、p38MAPK及JNK各自的拮抗剂(PD98059、SB203580及SP600125)与上皮细胞孵育后,NE再进行诱导,检测MUC5ACmRNA的表达。 结果⒈同一浓度NE与气道上皮细胞孵育后,MUC、MUC5AC表达及MUC5ACmRNA水平在一定的时间范围内呈时间依赖性关系;⒉不同浓度NE与气道上皮细胞孵育后,MUC、MUC5AC表达及MUC5ACmRNA水平在一定的浓度范围内呈浓度依赖关系;⒊NE刺激后不仅引起MUC5AC基因转录和蛋白表达水平显著高于未给予NE刺激的对照组(p<O.01),同时伴随可溶性TGF-a及磷酸化EGFR蛋白水平的增高,与对照组相比,差异有统计学意义(p<0.01),但对单纯TGF-a刺激引起的MUC5AC基因转录和蛋白合成增加无明显作用,与单纯TGF-a刺激组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。⒋ERK拮抗剂可有效阻断NE诱导上皮细胞MUC5ACmRNA水平的升高;而p38MAPK及JNK的拮抗剂对NE.诱导上皮细胞MUC5ACmRNA水平影响不大。 结论⒈NE是气道上皮细胞MUC5AC转录及MUC、MUC5AC表达的强力诱导剂;⒉NE能刺激产生ROS,再活化TACE引起黏蛋白产生增多,组成EGFR通路上游的主要信号分子,其下游信号经MAPK中的ERK通路下传。故ROS/TACE/pro—TGF-a/EGFR/ras/raf/MAPK/ERK转导途经是NE引起气道黏液高分泌的重要机制。 第四部分 重组elafm腺病毒载体转染气道上皮细胞对弹性蛋白酶诱导黏蛋白高分泌的影响 目的重组elafin腺病毒Ad-elafin表达载体转染气道上皮细胞后,通过对弹性蛋白酶(NE)诱导的elafin基因转录及蛋白分泌、黏蛋白(MUC)5AC基因转录、蛋白分泌的观察,探讨elafin对NE诱导上皮细胞MUC高分泌的影响。 方法:⒈原代培养技术培养人气道上皮细胞并Ad-elafin表达载体转染气道上皮细胞。⒉实验组:不同浓度(O.25、0.5、1.O、2.0、4.0um/L)NE+Ad-Matin表达载体转染的气道上皮细胞;对照组:无NE诱导的Ad-elafin表达载体转染的气道上皮细胞。⒊NE刺激24h后细胞有形成分抽提RNA,RT-PCR检测elafinmRNA及MUC5ACmRNA水平;ELISA法检测细胞上清液中elafin及MUC5AC的含量。 结果:⒈与对照组相比较,经与NE孵育后,elafinmRNA的表达量依NE的不同浓度分别升高为:0.25UlTI/L:184.34-58.3%、0.5um/C:3544-86.5%、1.Oum/L:5634-112.7%、2.0tlm/C:4704-933%:4.0um/C为3014-76.4%。NE浓度介于0.5-4.0um/C之间时,具有统计学意义(P<0.05);尽管elafinmRNA水平上升,但细胞上清液中elafin却是降低的。⒉1.OUlTI/LNE孵育Ad-elafin表达载体转染的气道上皮细胞,MUC5ACmRNA是对照组的56.2%,细胞上清液中MUC5AC分泌量是对照组的30.8%,具有统计学意义(P<0.05)。 结论:⒈NE可上调重组elafin腺病毒Ad-elafin表达载体转染气道上皮细胞elafinmRNA水平;⒉Elafin可下调MUC5ACmRNA水平,且上皮细胞MUC5AC表达降低。
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