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邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)与隐睾发病的相关性及分子机制研究
中文名称: 邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)与隐睾发病的相关性及分子机制研究
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论文编号: 3122212收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Pathogenesis of Cryptorchidism in Mice Induced by Di(2-Ethylhexyl) Phthalate
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 儿科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP) 隐睾 睾丸Leydig细胞 小鼠 胚胎 邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯 原位分子杂交 逆转录聚合酶链反应
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论文简介:全文分为二部分 第一部分DEHP与小鼠隐肇发生的相关性研究 目的:探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEI-IP)与小鼠隐睾发生的相关性及其对小鼠睾丸组织学的影响。 方法:健康KM孕鼠随机分成5组:正常对照组、玉米油对照组(玉米油2ml/kg.d)、DEHP低剂量组(DEHP100mg/kg.d)、DEHP中剂量组(DEHP200mg/kg.d)、DEHP高剂量组(DEHP500mg/kg.d)。各组分别于孕鼠妊娠第12d至产后3d(GD12~PND3)(雄性胎鼠睾丸下降的关键时期)持续经口灌注给药。GD19处死孕鼠,剖宫产取出胎鼠,记录每只孕鼠胎鼠数、雄性胎鼠比例、胎鼠体重等情况,同时在解剖显微镜下观察雄性胎鼠睾丸位置、睾丸引带发育状况、颅侧悬韧带残留情况、测量睾丸至膀胱颈的相对距离,观察各组胎鼠睾丸形态学变化及PND30时的仔鼠隐睾发生率。 结果:⒈DEHP对孕鼠胎鼠数未产生明显作用,但对胎鼠体重有一定影响;⒉不同剂量DEHP对胎鼠性腺分化未产生严重干扰;雄性仔鼠比例与对照组没有显著差异。⒊正常胎鼠睾丸位于肾脏下极与膀胱颈之间,大多数睾丸位置靠近膀胱颈,颅侧悬韧带完全退化;⒋HE染色,光镜下观察见DEHP组睾丸生精小管、支持细胞存在明显的发育障碍,DEHP高剂量组睾丸Leydig细胞明显增生;⒌小鼠隐睾发生率与DEHP的剂量有一定的相关性,DEHP高剂量组隐睾发生率明显高于其他组。 结论: ⒈DEHP是一种环境内分泌干扰因子,能诱发小鼠隐睾;对胎鼠性别分化无明显影响。 ⒉DEHP影响睾丸发育及干扰睾丸下降,并造成睾丸支持细胞、睾丸Leydig细胞和生精细胞发育障碍和功能变化; 第二部分 DEHP诱发小鼠隐翠的分子机制研究 目的:探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)诱发小鼠隐睾的分子机制。 方法:选择胎龄16d的胎鼠睾丸,0.03%胶原酶I消化,3B-HSD染色鉴定及纯度测定,锥虫蓝染色检测细胞活率。放免法测定睾丸Leydig细胞不同培养时间及密度下分泌睾酮的水平。体外实验中,DEHP染毒剂量分为25、50、100、200mg/L,通过检测睾酮合成关键酶3p-HSD活性、放免法测定培养液中睾酮浓度,研究DEHP对睾丸Leydig细胞形态及超微结构、功能的影响,用MTT法和Annexin-V/PI流式细胞术分别检测DEHP对睾丸Leydig细胞活力的影响及毒性作用以及凋亡诱导作用,应用RT-PCR和原位分子杂交技术检测DEHP对睾丸Leydig细胞INSL3mRNA表达的影响。体内实验:DEHP分别以低、中、高三组剂量[100、200、500mg/(Kg.d)]灌胃作用于怀孕12d到产后3d(GDl2~PND3)的KM母鼠,观察DEHP对新生雄性仔鼠体重、睾丸重量、睾丸Leydig细胞形态结构和3p-羟基类固醇脱氢酶(3p-HSD)活性、酶反应面积的影响,RT-PCR检测新生小鼠睾丸INSL3mRNA表达的相对强度变化。 结果: 1.睾丸Leydig细胞培养前后纯度分别为(45.10±1.66)%和(81.17±2.32)%;培养液中可检测到睾酮,睾酮水平与睾丸Leydig细胞数、培养时间相关,单个睾丸Leydig细胞睾酮分泌能力逐日下降。2.DEHP(25mg/L)处理12h,或DEHP(50mg/L)处理6h后,实验组与对照组比较3p-HSD酶活性明显降低(P<0.05),随着时间延长和药物浓度增加差异更显著(P<0.01)。DEHP50mg/L、100mg/L实验组,在12、24h的睾酮水平明显低于对照组(P<0.05或P<0.01),存在时间-效应关系;DEHP200mg/L实验组在6、12、24h与对照组比较均有非常显著差异(P<0.01)。DEHP200mg/L实验组可观察到睾丸Leydig细胞明显的细胞形态学改变。 3.睾丸Leydig细胞活力随着DEHP浓度增加和作用时间延长而明显下降;Annexin-V/PI流式细胞术检测提示死亡细胞比例随DEHP浓度升高和作用时间延长而显著增加,同时细胞增殖速度变慢,甚至增殖停止,伴随一系列细胞形态学及超微结构改变,呈剂量、时间依赖关系。 4.各DEHP处理组透射电镜可见凋亡典型的形态学变化,凋亡指数及凋亡细胞比例与对照组比较有显著或非常显著差异。(P<0.05或P<0.011)。 5.DEHP作用于母鼠后,其雄性子代幼鼠体重和睾丸重量减轻,睾丸Leydig细胞形态、超微结构发生改变;高剂量组睾丸Leydig细胞数量明显增多;低、中剂量组睾酮合成关键酶3p.HSD酶活性下降,酶反应面积减小,但高剂量组在PNDl5d时酶活性降低(P<0.01),而酶反应面积增大(P<O.01)。 6.DEHP改变原代培养的小鼠胚胎睾丸Leydig细胞和新生小鼠睾丸的组织、细胞形态结构;各实验组包括原代睾丸Leydig细胞及不同时间点的新生鼠睾丸INSL3mRNA表达水平、表达相对强度均明显低于对照组(P<0.01,或P<0.01)。 结论:本实验所用方法分离的胚胎睾丸Leydig细胞纯度较高,生长性好,保持增殖和分泌睾酮的生物学特性,为进一步相关的研究建立了基础。DEHP影响原代培养小鼠胚胎睾丸Leydig细胞3β-羟基类固醇脱氢酶活性,并抑制睾酮合成,降低睾丸Leydig细胞的活性并促进其死亡,诱导睾丸Leydig细胞凋亡,有明显细胞毒性;DEHP也影响新生小鼠体重、睾丸重量、睾丸Leydig细胞的形态结构和3β-HSD活性,下调睾丸Leydig细胞INSL3mRNA的表达,具有抗雄激素效应。
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