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广谱脱氧核酶抗不同免疫功能小鼠呼吸道合胞病毒感染的研究
中文名称: 广谱脱氧核酶抗不同免疫功能小鼠呼吸道合胞病毒感染的研究
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论文编号: 3122209收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Inhibitory Effect of Broad-Spectrum Deoxyribozyme on Respiratory Syncytial Virus in Mice with Different Immune Functions
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 儿科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 呼吸道合胞病毒 脱氧核酶 抗病毒作用 小鼠 免疫 病毒感染 免疫功能
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论文简介:背景和目的 呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvires,RSV)是全世界婴幼儿下呼吸道感染首位病毒病原体,人群普遍易感,早产儿、骨髓移植病人、先天性心脏病以及免疫功能不全患者等高危人群常发生严重感染甚至死亡。RSV有A、B两个抗原亚型,各亚型有众多病毒株,是高度变异的RNA病毒,初次感染通常不产生有效的免疫保护作用,易于再感染,病毒变异给预防和治疗带来困难,目前尚无安全有效的RSV疫苗和抗病毒药物问世。 10一23型脱氧核酶(Deoxyribozyme,DNAzyme,DZ)是体外筛选获得具有特异性RNA切割活性的DNA分子,是新型的基因治疗工具,已用于感染、肿瘤、遗传代谢等疾病的研究,可有效抑制靶基因表达。我们在前期研究中,针对RSV基因组或mRNA设计多种脱氧核酶,筛选出有效抗RSV的DZ604、DZ8269和DZll33,其中DZ¨33是以RSV生活周期中起重要作用的N蛋白基因的保守序列为靶点,抑制A、B两个亚型RSV在感染细胞中的复制。本研究在正常和免疫缺陷小鼠建立RSV感染模型,研究DZ¨33对RSV感染不同免疫功能小鼠的保护作用;研究DZ¨33在小鼠体内对RSVA、B两个亚型标准株和地方分离株的广谱抗病毒作用;比较针对RSV相同靶序列的脱氧核酶DZ¨33和反义寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)AS1133以及抗RSV药物利巴韦林在小鼠体内的抗病毒效果;寻求在免疫功能正常和免疫缺陷个体内,对A、B两个亚型标准株和地方分离株病毒都有效的广谱抗RSV制剂。 方法 RSVA亚型标准株A2株、B亚型标准株CHl8537株和4株重庆、北京地方分离株病毒分别滴鼻感染BALB/c鼠,RSVA2株感染裸鼠,各治疗组小鼠在感染后24h和48h分别给予不同剂量胆固醇连接和部分硫代修饰的DZ1133和AS¨33,以及利巴韦林滴鼻,未感染RSV、DZ¨33滴鼻的小鼠为阴性对照,感染后未治疗的小鼠为感染对照,未经任何处理的小鼠为空白对照。取感染BALB/c鼠和裸鼠肺、肝、脾、肾组织进行病毒分离。感染后不同时间空斑形成实验检测各治疗组和感染对照组BALB/c鼠和裸鼠肺组织病毒滴度,计算各治疗组空斑形成抑制率。冰冻切片分析荧光标记DZll33在BALB/c鼠肺组织分布,RT-PCR检测肺组织RSVN基因、Tolllikereceptor4(TLR4)和TLR2mRNA表达,原位杂交检测肺组织RSVmRNA表达和分布,直接免疫荧光检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中RSV抗原,免疫组织化学检测肺组织病毒抗原。BALF中白细胞及其分类计数、肺组织光镜、电镜病理学分析气道炎症。免疫组织化学检测空白对照和感染BALB/c鼠和裸鼠肺组织CDl4+细胞和CD56+细胞,流式细胞术分析外周血CD4+细胞和CD8+细胞比例,ELISA检测血浆总IgE和BALF中细胞因子tNF-fl、IFN-~、IL.12和IL一10的水平。 结果 RSV感染BALB/c鼠和裸鼠肺组织分离到病毒,肝、脾、肾组织均未分离到病毒,两种小鼠肺组织病毒滴度高峰都在感染后第3天(PID3),裸鼠在PID9病毒滴度仍较高,BALB/c鼠在PID7就检测不到病毒。RSV感染BALB/c鼠和裸鼠BALF免疫荧光和肺组织免疫组化都检测到RSV抗原,肺组织呈明显间质性炎症改变。与空白对照BALB/c鼠和裸鼠比较,感染BALB/c鼠和裸鼠肺组织TLR4表达增强、血浆总IgE升高、肺组织CDl4+细胞和CD56+细胞数目增多,BALF中白细胞总数增加,以淋巴细胞为主,TNF-(I、IFN-7、IL一12和IL-10水平升高。感染裸鼠与感染BALB/c鼠比较,肺组织RSV滴度和抗原表达更高,病理损害更重,BALF中白细胞数目和TNF-a、IL一12、IL一10水平更高,肺组织CDl4+细胞和CD56+细胞数目更多。感染BALB/c鼠血浆总IgE水平比感染裸鼠高,外周血CD4+淋巴细胞比例比空白对照BALB/c鼠升高。 滴鼻给予DZll33在BALB/c鼠肺组织中分布良好。DZ¨33治疗组BALB/c鼠和裸鼠与感染对照BALB/c鼠和裸鼠比较,肺组织病毒滴度降低,0.2mg、0.4mg和0.8mgDZ¨33治疗的病毒空斑形成抑制率在PID3的BALB/c鼠是65.88%、78.06%和85.83%,裸鼠在PID3是91.92%、97.05和98.51%,PID6是91.61%、97.04%和98.05%。0.2mg、0.4mg和0.8mgDZ1133治疗组BALB/c鼠肺组织RSVN基因mRNA表达下降率分别是30.51%、47.38%和53.97%,相应的治疗组裸鼠病毒mRNA表达下降36.59%、48.72%和59.78%。DZ1133抗RSV作用随剂量加大而增强。0.4mgDZ1133抑制感染BALB/c鼠和裸鼠肺组织原位杂交RSVmRNA的分布和表达,减少肺组织RSV抗原免疫组化的平均光密度,降低BALF中白细胞数,改善肺组织病理损害。 0.4mgDz1133处理的阴性对照BALB/c鼠和裸鼠没有明显肺组织病理改变,BALF中TNF—α和IFN—γ比空白对照BALB/c鼠和裸鼠升高。 0.4mgDz¨33滴鼻降低6株不同RSV感染BALB/c鼠肺组织病毒滴度,包括RSVA亚型标准株A2株、B亚型标准株CHl8537株、重庆地区A亚型分离株CQ381513株和B亚型分离株CQ38¨70株、北京地区分离株BJ01株和BJ04株,与各自的感染对照组比较,各DZ¨33治疗组肺组织病毒空斑形成抑制率分别是70.34%、73.29%、82.23%、81.97%、68.89%、71.45%,RSVN基因mRNA表达下降率分别是48.89%、53.18%、74.83%、64.37%、43.57%、58.07%,肺组织RSV抗原免疫组化的平均光密度降低,肺组织充血水肿和炎症细胞浸润减少,病理损伤减轻。 DZ¨33和AS1133滴鼻处理降低RSVA2株感染BALB/c鼠肺组织病毒滴度,与感染对照组比较,0.2mgDz¨33和AS1133治疗组病毒空斑形成抑制率分别是65.88%和34.48%,0.4mgDz1133和AS¨33治疗组抑制率分别是78.06%和46.75%,0.4mg利巴韦林治疗组肺组织病毒滴度没有明显变化,0.8mg利巴韦林治疗组病毒空斑形成抑制率为23.02%;0.4mgDZ¨33和AS¨33治疗组肺组织RSVN基因mRNA表达分别下降47.38%和30.54%,RSV抗原免疫组化的平均光密度降低43.5%和31.06%,肺组织病理改变明显改善;0.4mg利巴韦林治疗组RSV抗原平均光密度下降28.71%,N基因mRNA表达和组织病理学改变没有显著变化。 结论 1.RSV感染免疫功能正常的BALB/c鼠和细胞免疫缺陷的裸鼠有相似的病毒复制和炎症反应特点,裸鼠病毒复制水平更高、持续时间更长。 2.RSV感染裸鼠的气道炎症反应比感染BALB/c鼠更重。RSV感染的炎症反应程度与细胞免疫应答不平行。 3.脱氧核酶DZ1133有效抑制BALB/c鼠和裸鼠体内RSV复制,降低病毒基因和蛋白表达,改善气道炎症病理损伤,抗RSV作用随剂量加大而增强,对裸鼠的保护作用更突出。 4.未发现DZll33明显的肺组织病理损伤作用。 5.DZll33对RSVA、B亚型标准株、重庆和北京地区分离株病毒感染的小鼠都有保护作用。 6.DZll33在小鼠体内抗RSV活性比利巴韦林和反义寡核苷酸更强。 7.DZ¨33是有效、广谱、安全的体内抗RSV制剂。
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