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抑癌基因maspin在肝癌中的作用及机制的实验研究
中文名称: 抑癌基因maspin在肝癌中的作用及机制的实验研究
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论文编号: 3122197收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Expremental Research of Effection and Mechanism on Maspin Gene in the Hepatocellular Cancer
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: maspin抑癌基因 原发性肝癌 生长、浸润、转移 抑癌基因 maspin 肝癌 肿瘤抑制
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论文简介:目的:原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率、复发率和死亡率有增加的趋势,肝癌的浸润和转移常常是治疗失败以及影响患者生命的重要原因。肝癌的浸润、转移受到许多特殊基因的调控,是一个多基因、多阶段的复杂过程,涉及到癌基因和抑癌基因,而且这些机理仍未阐明。 maspin基因是通过消减杂交技术,在上皮细胞的mRNA水平上发现的。目前的研究证实抑癌基因maspin具有抑制肿瘤生长、浸润、血管生成、转移的作用,同时又有促进肿瘤细胞凋亡的作用,在临床上可以作为肿瘤转移、预后及肿瘤常规化疗疗效动态监测的指标。本研究涉及细胞生物学、分子生物学、实验动物学等领域,首先检测临床肝癌组织中maspin蛋白和mRNA的表达;同时构建maspin/pEFIRES-N表达载体,将其转染入肝癌细胞株MHCC-97中,观察对肝癌细胞株MHCC-97生长、浸润和转移的影响;并构建肝癌裸鼠移植瘤模型,观察再表达maspin对裸鼠移植瘤生长的抑制作用,为进一步研究抑癌基因maspin在肝癌中的作用及机制,及为肝癌的基因治疗提供理论基础和技术支持。 方法: 1.抑癌基因maspin在肝癌中的表达及其与uPA、VEGF和AFP的相关性:应用免疫组织化学和RT-PCR在蛋白和mRNA水平上检测maspin、VEGF、uPA和AFP在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的表达; 2.设计、构建maspin/pEFIRES-N表达载体:获取maspin基因后,经过酶切和连接,将maspin基因定向克隆至pEFIRES-N表达载体上,进行DNA测序鉴定。用脂质体将maspin/pEFIRES-N表达载体转染入肝癌细胞株MHCC-97内,并稳定筛选。应用RT-PCR、Westernblotting检测maspin、VEGF和uPA的mRNA和蛋白表达,用MTT、细胞增殖抑制试验和maspin/pEFIRES-N对肝癌MHCC-97侵袭能力的实验,观察肿瘤细胞的凋亡、增殖和侵袭能力,了解maspin抑癌基因对肝癌细胞株MHCC-97的抑制情况; 3.观察再表达maspin基因在体内对肝癌裸鼠移植瘤生长的影响:成功建立BALB/c裸鼠肝癌细胞MHCC-97异种移植瘤模型后,分别用maspin/pEFIRES-N表达载体和pEFIRES-N表达载体来处理裸鼠移植瘤,用免疫组织化学和透射电镜观察处理后裸鼠移植瘤的生长情况。 结果: 1.抑癌基因maspin在肝癌中的表达及其与VEGF、uPA和AFP的相关性: 1.)RT-PCR和免疫组织化学方法证实maspin基因在正常肝组织中有较高表达,而在癌旁组织中的表达呈弱阳性,在肝癌组织中几乎不表达,因此maspin在这三种组织中的表达呈下降的趋势;而VEGF、uPA和AFP在这三种组织中的表达却正好相反,呈上升的趋势; 2.)在正常肝组织、癌旁组织、肝癌组织中maspin与VEGF、uPA和AFP蛋白的面密度相比较,P<0.05,证实在正常肝组织、癌旁组织、肝癌组织中maspin与VEGF、uPA和AFP分别相比有显著性差异;maspin与VEGF的相关系数r=-0.896,与uPA的相关系数r=-0.970,与AFP的相关系数r=-0.981,三者均为负值,说明maspin与三者呈负相关;同时maspin与肝癌的恶性程度呈负相关; 2.再表达maspin基因对肝癌细胞MHCC-97生长、浸润、转移的影响: 1.)成功构建maspin/pEFIRES-N重组质粒,获取maspin基因后,经过酶切和连接,将maspin基因定向克隆至pEFIRES-N表达载体上,进行DNA测序鉴定,证实构建成功;同时将对已稳定转染maspin/pEFIRES-N表达载体的肝癌细胞MHCC-97,通过PCR扩增,可得到410bp的扩增产物,说明转染质粒DNA已整合到MHCC-97细胞染色质上,稳定筛选建株成功; 2.)maspin、VEGF和uPA在mRNA水平的表达,稳定转染前后maspinmRNA平均光密度值分别是0.3806~0.0715和1.4565~0.32l8,P<0.05,差异具有显著性;稳定转染前后VEGFmRNA平均光密度值分别是0.7352~0.2264和0.4372+0.1736,P<0.05,差异具有显著性;稳定转染前后uPAmRNA平均光密度值分别是0.68634-0.1657和0.3753+0.1846,P<0.05,差异具有显著性。结果提示,再表达maspin可抑制VEGF和uPA基因的表达,对肝癌细胞MHCC一97的生长、转移和浸润有抑制作用; 3.)maspin、VEGF和uPA在蛋白水平的表达,与pEFIRES-N转染组相比,maspin/pEFIRES-N转染组中maspin蛋白表达平均上升了59.2%,而uPA和VEGF的蛋白表达平均下降了41.8%和50.9%,其差异具有显著性意义(P<0.05); 4.)肝癌细胞MHCC-97周期相分布,与pEFIRES-N处理组比较,maspin/pEFIRES-N组细胞周期中,S期细胞明显减少,而G0/G1期细胞明显增多,提示经maspin/pEFIRES-N作用肝癌细胞MHCC-97后,肝癌细胞MHCC-97的增殖能力减弱,导致细胞凋亡,并出现凋亡峰,细胞凋亡率为22.95%,而pEFIRES-N处理组肝癌细胞MHCC-97周期相无明显改变,细胞凋亡率为237%: 5.)肝癌细胞MHCC-97增殖抑制试验,细胞增殖抑制试验maspin/pEFIRES-N稳定转染组中,平均吸光度值明显低于pEFIRES-N质粒转染组。maspin/pEFIRES-N稳定转染组肝癌细胞MHCC-97增殖抑制率平均达58%,与pEFIRES-N质粒转染组相比,P~0.05,差异具有显著性意义; 6.)maspin/pEFIRES-N对肝癌细胞MHCC-97侵袭能力的实验,pEFIRES-N稳定转染组肝癌细胞MHCC-97穿膜侵袭细胞数目为273.48+13.15;maspin/pEFIRES-N稳定转染组中MHCC-97穿膜侵袭细胞数目为186.32+10.15,二者相比,P<0.05,具有显著性差异; 3.再表达maspin基因在体内对肝癌裸鼠移植瘤生长的影响: 1.)成功地构建人肝癌裸鼠异种移植瘤,12只BALB/c裸鼠分别接种1×107个/ml肝癌MHCC-97细胞,平均7日(7土2d)后可出现肉眼可见肿瘤,成瘤率为100%(12/12),达到瘤体积为50~70mm3的平均时间为10+4天;随机分成2组,分别用maspin/pEFIRES-N和pEFIRES-N质粒处7次后,可见maspin/pEFIRES-N治疗组比pEFIRES-N质粒处理组肿瘤明显小,生长缓慢;maspin/pEFIRES-N治疗组平均瘤体积为原来体积的61%,pEFIRES-N质粒处理组平均瘤体积为原来体积的193%,两组相比较,差异具有显著性(P<0.05,其差异具有显著性意义;同时也进行了微血管密度(MVD)的检测,两组相比,P<0.05,其差异具有显著性意义。 结论: 1.maspin抑癌基因在正常肝组织中有高表达,而在癌旁组织中呈低表达,在肝癌组织中几乎无表达;VEGF、uPA和AFP蛋白却在上述三组织中的表达正好相反,maspin与之呈负相关;且maspin与肝癌的恶性程度也呈负相关; 2.成功构建了maspin/pEFIRES-N表达质粒;利用maspin/pEFIRES-N表达载体,成功地转染入肝癌细胞株MHCC一97;发现在MHCC-97细胞中,再表达maspin基因能促进肝癌细胞MHCC-97凋亡、抑制其增殖,降低VEGF和uPA在肝癌细胞MHCC-97中的表达,降低其穿膜能力; 3.成功建立人肝癌BALB/c裸鼠移植瘤模型; 4.利用maspin/pEFIRES—N表达质粒抑制了人肝癌BALB/c裸鼠移植瘤的生长; 5.对maspin基因再表达,抑制肿瘤细胞肿瘤生长、浸润、转移的准确调控机制目前仍然没有完全阐明,还需要进行更深入的研究。
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