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转基因神经干细胞联合移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究
中文名称: 转基因神经干细胞联合移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究
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论文编号: 3122189收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Combined Transplantation of hBDNF-Transfected NSCs and hVEGF_(165)-Transfected NSCs for Rats Following Traumatic Brain Injury
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 神经干细胞 创伤性脑外伤 基因治疗 脑源性神经生长因子 血管内皮细胞生长因子 转基因 神经干细胞移植
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论文简介:创伤性脑外伤(traumaticbraininjury,TBI)常常引起神经细胞大量的死亡和严重的神经功能障碍,由于中枢神经系统缺乏再生能力,因此目前认为治疗创伤性脑外伤的关键是:移植外源性细胞补充或替代损失的神经细胞和施加外源性的神经营养因子促进残存神经细胞的存活、轴突的生长和功能性突触的重建。因此,移植转基因神经干细胞治疗创伤性脑外伤具有良好的应用前景,一方面神经干细胞可以在中枢神经系统内良好地整合,补充或替代损失的细胞,参与神经结构的重建,另一方面其分泌的外源性细胞因子可以改善损伤局部的微环境促进神经再生。在本研究中,我们在探讨移植神经干细胞促进创伤性脑外伤大鼠神经功能障碍改善的机制的基础上,进一步探讨移植hBDNF转基因神经干细胞和hVEGFi65转基因神经干细胞对创伤性脑外伤大鼠神经功能障碍和学习记忆功能障碍改善的影响。 一、神经干细胞移植促进创伤性脑外伤大鼠神经功能障碍改善的实验研究 建立大鼠创伤性脑外伤模型,并分为3组,I组为对照组不移植、II组移植PBS、ⅡI组移植神经干细胞。用TUNEL法检测外伤后24h和移植后3d、7d、2w和3w时大鼠大脑皮层、白质和海马中神经细胞凋亡情况,应用免疫组织化学染色方法检测在移植后3d、7d、2w时移植细胞在宿主脑内存活、迁移和分化情况。应用RT—PCR法检测损伤局部中细胞因子的表达水平。应用NSS评分评价外伤后大鼠神经功能情况。结果:神经干细胞移植后可以在体内长期存活,并可以由移植点向损伤灶方向迁移。在移植后7d可以观察到由移植细胞分化而来的星形胶质细胞,在移植后14d可以观察到由移植细胞分化而来的神经元。RT—PCR结果表明移植后7d,与I组相比,III组大鼠损伤局部NGF、BDNF、GDNF和CNTF的表达水平明显增高(P<0.05)。TUNEL结果表明在移植后7d,ⅡI组大鼠皮层、白质和海马中神经细胞的凋亡数量明显低于I组大鼠(P<0.05)。NSS评分显示在移植后7d,IⅡ组大鼠NSS评分明显低于I组大鼠(P<0.05)。结论:移植的神经干细胞可以通过上调损伤局部神经营养因子的表达水平发挥神经保护作用。 二、hFIDNF真核细胞表达载体的构建和稳定表达hBNDF基因神经干细胞克隆的建立 (一)携带IRES的hBDNF绿色荧光蛋白表达载体的构建和鉴定 采用PCR方法从正常人基因组中扩增出hBDNF基因,用XhoI和SalI双酶切后克隆到真核细胞表达载体plRES2~EGFP中,对重组质粒进行双酶切、PCR和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipo~ectamine2000将重组的质粒转染至真核细胞(293一T)中,用RT-PCR、WesternBlotting、荧光显微镜检测基因在239一T细胞中表达的情况。结果:双酶切、PCR和质粒测序结果证明hBDNF已正确地克隆到真核表达载体plRES2一EGFP中,质粒能在293一T细胞中正常表达。结论:我们成功构建了plRES2一hBDNF—EGFP表达载体,为利用hBDNF治疗中枢神经系统疾病奠定了坚实的基础。 (二)稳定表达plRES2-hBDNF—EGFP神经干细胞克隆的建立和鉴定将10gg去内毒素质粒和1×106个神经干细胞在200lI低渗透压缓冲液中混匀,分别以电压300V一900V,脉冲时间50gs一150gs条件进行电穿孔转染,转染48h后用流式细胞仪分析各种条件的转染效率。应用含有200[tg/mLG418的培养液筛选转染后的神经干细胞14d,以获得稳定表达EGFP的神经干细胞克隆。将稳定表达的细胞克隆进行单细胞克隆培养以纯化稳定表达EGFP的神经干细胞。扩增稳定表达EGFP的转基因神经干细胞,利用流式细胞仪和RT—PCR分析转基因神经干细胞表达外源性基因的情况。结果:流式细胞仪检测结果表明在电压为700V、脉冲长度为100gs时转染效率最高,为12.65%。电穿孔后,细胞经过G418筛选14d后可以获得少量稳定表达EGFP的神经干细胞克隆。将表达EGFP的细胞克隆进行单细胞克隆培养后可以获得纯化的细胞克隆。纯化的细胞克隆扩增后应用流式细胞仪检测证明98%以上表达EGFP,RT—PCR检测证明稳定表达EGFP的神经干细胞同样表达hBDNF基因。结论:电穿孔法可以有效的转染神经干细胞,最佳的电穿孔参数为电压为700V,脉冲长度为100gs,经过G418筛选后可以获得稳定表EGFP和hBDNF基因的神经干细胞克隆。 三、转基因神经干细胞联合移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究 将脑外伤大鼠模型分为5组,I组不移植,II组移植神经干细胞,III组移植hVEGFl65转基因神经干细胞,Ⅳ移植hBDNF转基因神经干细胞,V组移植hVEGFl65转基因神经干细胞和hBDNF转基因神经干细胞。在移植后3d、7d、2w和3w通过荧光显微镜观察移植细胞在脑内的存活、迁移和分化。应用RT—PCR和ELISA法检测转基因神经干细胞在脑内表达外源性基因的情况。应用TUNEL法和免疫组织化学染色法分析在外伤后大鼠内源性新生神经元、神经细胞凋亡、迁移至损伤灶边缘的神经干细胞数量和微血管密度的变化情况。应用NSS评分和Morris水迷宫测试评价移植细胞对大鼠神经功能障碍、学习记忆功能障碍恢复的影响。结果:hBDNF在体内可以长期表达,而hVEGFl65在体内的表达仅维持在4w内。移植后3d,Ⅳ组和V组大鼠各脑区内神经细胞凋亡数量明显低于I组大鼠(P<0.01),移植后7d,II组和IⅡ组大鼠各脑区内神经细胞凋亡数量明显低于I组大鼠(P<0.05)。移植后3w,Ⅳ组和V组大鼠的平均逃避潜伏期明显低于I组大鼠(P<0.05),移植后5w,IⅡ组大鼠的平均逃避潜伏期明显低于I组大鼠(P<0.05)。移植后7d,与I组大鼠相比,III组和V组大鼠的损伤局部微血管密度明显增高(P<0.01),迁移至损伤灶边缘的细胞数量明显增加(P<0.01)。在移植后3d,Ⅳ组和V组大鼠NSS评分明显低于I组大鼠(P<0.05),移植后7d,II组和III组大鼠NSS评分明显低于I组大鼠(P<0.05)。结论:移植hVEGFl65转基因神经干细胞和hBDNF转基因的神经干细胞都能够促进大鼠神经功能和学习记忆功能障碍的恢复,但是两者联合移植时产生的神经保护作用更显著。
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