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IRAK-4在内毒素诱导的再灌注期移植肝脏枯否细胞激活中的调控作用
中文名称: IRAK-4在内毒素诱导的再灌注期移植肝脏枯否细胞激活中的调控作用
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论文编号: 3122188收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Role of IRAK-4 on Kupffer Cells Activiation Induced by Endotoxin in Transplantative Liver during Ischemia/Reperfusion Phase
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 肝移植 缺血再灌注损害 内毒素 枯否细胞 白细胞介素-1受体相关激酶 缺血再灌注 移植肝脏
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论文简介:目的:缺血再灌注损害(ischemia/reperfusioninjury,I/RI)是导致移植肝功能不良或无功能、进而造成移植失败,机体死亡的重要原因之一,目前仍无有效的治疗对策。全身80%一90%的单核一巨噬细胞为滞留于肝血窦内的kupffer细胞(kupffercells,KCs)。实际上,KCs过度激活导致促炎症细胞因子肿瘤坏死因子一Q(tumornecrosisfactor,TNF-~)释放是引发肝脏工/RI的关键因素。已证实内毒素是造成肝移植再灌注期KCs过度激活的重要原因之一。内毒素是革兰氏阴性杆菌生长时释放或死亡时裂解出来的细胞壁脂多糖(1ipopolysacharide,LPS)成分,主要通过与单核一巨噬细胞相结合而诱导相应的生物效应。实验证明,大鼠经小剂量内毒素预处理诱导内毒素耐受(endotoxintolerance,ET)后,能对随之发生的I/R工产生交叉耐受(cross-toleration)作用,此时TNF—Q含量明显下降,工/R工程度显著减轻,但其相关机制并未完全阐明。最新研究表明,白细胞介素一1受体相关激酶一4(interleukin一1receptorassociatedkinase-4,IRAK-4)是位于NF-KB上游的调节内毒素信号转导的最关键因子[3]。工RAK-4不仅可能是LPS信号转导的最关键调控分子,其活性变化还可能是诱导ET形成的最关键因素,因此也应该是最理想的治疗靶点。 目前,临床上对I/R工的防治并无有效的手段;而内毒素临床应用的安全性尚有待评估,同时在术前数天给于内毒素预处理供体以期诱导盯也并不现实,因此如能证实IRAK一4活性改变也是内毒素预处理诱导的对I/RI交叉耐受的关键步骤,将有可能为防治肝移植I/R工的基因治疗提供理想的治疗靶点。然而,作为2002年才被发现的IRAK家族最新成员,还有许多问题尚待解决:⑴诱导ET后,最终能抑制工RAK一4活性,但目前并未分离出明确的活性调控蛋白。IRAKs家族活性的变化可能是田形成的最关键因素,是由于其他信号转递因子均不是诱导ET形成的必需条件。由于认知的局限性,并不能排外关键性调控因子尚未被发现的可能,因此IRAK一4活性的变化是否是ET形成的最关键因素仍有待进一步证实。⑵现有的研究均以腹腔或血液巨噬细胞,甚至肿瘤性巨噬细胞株等为研究对象,尚无研究工RAK-4在KCs内毒素信号转导中的调控效应;也未涉及因为肝移植(其血液LPS浓度明显低于实验用LPS浓度,但KCs对LPS高度敏感)的特殊情况下IRAK一4的调控作用。更无抑制IRAK一4表达后,对I/R工是否具有交叉耐受效应的研究。⑶另外,IRAK-4基因敲除动物或IRAK-4基因突变的患者,因对LPS永久性无应答会导致反复严重的细菌感染。I/RI只是肝移植早期的一个病理生理过程,那能否短暂封闭特定靶器官的IRAK一4基因,而不会长期干扰机体对细菌的清除? 因此,在本实验中我们将观察:⑴以内毒素耐受(ET)为基础诱导的大鼠移植肝脏对缺血再灌注损害(工/RI)交叉耐受的过程中,白细胞介素一1受体相关激酶一4(工RAK-4)及相关内毒素信号转导分子表达的变化,分析内毒素在移植肝脏工/RI中的作用及诱导盯建立交叉耐受与IRAK一4表达改变的关系。⑵利用siRNA技术的转录后沉默特性,探讨以工RAK一4特异性短发夹RNA(shRNA)对内毒素诱导的枯否细胞(KCs)激活效应的可行性。⑶通过观察活体或冷保存期离体门静脉灌注大鼠供肝,转染IRAK-4shRNA对再灌注后受体肝脏工/R工及内毒素效应相关因子表达的影响,判断以IRAK-4为肝移植I/RI治疗靶点的可行性并探索可行的shRNA治疗途径。如果能证实IRAK-4在LPS诱导的KCs激活中的作用,在基因治疗日益向临床过渡的今天,将为肝移植工/R工的基因治疗或药物开发提供新的靶点,具有较大的理论意义和临床应用前景。 方法⑴雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、缺血再灌注组(I/R组)和内毒素耐受组(ET组)。以未经任何处理的大鼠肝脏为正常对照;盯组供体第M经尾静脉给予脂多糖(LPS)0.1mg.kg-',第2d、3d、4d、5d给予0.5mg.kg-1;I/R组供体给予等体积0.5ml无菌PBS液。第8d,切取供体,以未经任何处理的大鼠为受体,两袖套法建立大鼠原位肝移植模型。按门静脉血流恢复后第Omin、60min及180min分为三个亚组。光镜及电镜检查肝脏组织的病理改变情况;免疫组织化学及逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)测定肝组织的IRAK一4mRNA和蛋白表达水平;酶连免疫吸附法(ELISA)肝组织核因子一KB(NF-KB)活性及血清肿瘤坏死因子一Q(TNF—Q)含量。⑵构建2对表达IRAK-4-shRNA的阳性载体质粒(pSIIRAK-4-A,pS工IRAK-4-B)及l对阴性载体质粒(pS工IRAK一4-C)。分离培养Balb/C小鼠KCs,分为正常对照组,RNAi对照组(转染pSIIRAK一4-C)与RNAi抑制组(转染pS工IRAK-4一A,pSI工RAK一4-B)。质粒转染后24h,加入0.1μg·ml-1LPS。6h后,蛋白免疫印记法(Western-blot)及24一PCR测定IRAK-4蛋白和mRNA表达水平;ELISA检测0h,1h,3h,6h,12h后KCs的核因子一KB(NF一KB)活性及培养上清液TNF-Q含量。⑶雄性SD大鼠,随机分为冷缺血转染组、活体转染组、对照组,以两袖套法建立同种异体肝移植模型。冷缺血转染组于冷缺血期经门静脉灌注转染携带IRAK-4-shRNA的转染质粒pS工IRAK-4-A;活体转染组在门静脉袖套吻合完成后,经门静脉分支注入pSIIRAK-4-A;对照组不予任何处理。按门静脉血流恢复后第Omin、60min及180min分为三个亚组,光镜及透射电镜检查肝脏组织的病理形态学改变情况;免疫组织化学,Western-b10t及RT-PCR测定肝组织工RAK-4蛋白和mRNA表达;ELISA法检测肝组织NF一KB活性及血清TNF—Q含量。 结果⑴再灌注后Omin、60min及180min,I/R组与ET组的IRAK一4蛋白与mRNA表达水平,NF-KB活性以及TNF-Q含量均高于正常对照组(P<0.01);再灌注后Omin,工/R组与盯组的NF-KB活性以及TNF-Q含量差别无显著性(P>0.05),但IRAK-4蛋白与mRNA表达水平高于ET组(P<0.01);再灌注60min及180min,I/R组的上述各指标均明显高于后者(P<0.01)。再灌注后180min,ET组仅见轻度肝细胞、窦内皮细胞肿胀和炎症细胞浸润;I/R组的肝细胞、血窦内皮中度肿胀,血窦扩张,内有较多KCs和中性粒细胞浸润,部分血窦内皮消失,直接完全暴露的肝细胞个别见坏死,内质网扩张明显。⑵RNAi抑制组IRAK一4表达水平,以及LPS刺激后1h,3h及6h的NF-KB活性、TNF-Q含量均明显低于正常对照组和RNAi对照组(P<0.01);尤其是pSI工RAK-4一A组,LPS刺激前后上述各指标差异无显著性(P>0.05),抑制效果明显优于pS工工RAK一4一B(P<0.0D。⑶再灌注后活体转染组、对照组的工RAK-4蛋白与mRNA表达水平、NF-KB活性以及TNF-Q含量均高于冷缺血转染组(P<0.01);冷缺血转染组的IRAK-4表达明显抑制,再灌注后各时点差异无显著性(P>0.05)。再灌注后180min,冷缺血转染组超微结构改变与内毒素预处理后相似,仅见轻度肝细胞、窦内皮细胞肿胀和炎症细胞浸润;而活体转染组表现出明显的肝脏病理改变:其肝细胞明显气球样变、线粒体、血窦内皮中度一重度肿胀,内质网及血窦明显扩张,内有较多KCs和中性粒细胞浸润;部分血窦内皮消失,暴露的肝细胞直接与KCs接触,甚至可见个别肝细胞坏死。 结论⑴内毒素预处理可以减轻供肝的缺血再灌注损害。抑制IRAK-4表达,干扰内毒素信号转导,是以内毒素耐受为基础诱导的移植肝脏对工/R工交叉耐受的原因之一。⑵以IRAK-4为靶点的shRNA能有效的阻断内毒素诱导的KCs激活效应。⑶冷缺血期转染以IRAK-4为靶点的shRNAs能有效减轻肝移植时的工/RI,但由于IRAK一4主要分布在肝脏和肾脏组织,因此能否以IRAK-4作为预防其他器官I/RI的治疗靶点还需要进一步的深入研究。
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