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空肠弯曲菌多价DNA疫苗的实验研究
中文名称: 空肠弯曲菌多价DNA疫苗的实验研究
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论文编号: 3122163收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: An Experimental Study on the Polyvalent DNA Vaccine Against C.Jejuni
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 儿科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 空肠弯曲菌 重组质粒 DNA疫苗 壳聚糖 免疫应答 免疫保护力 周围神经 组织病理学
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论文简介:目前,空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)感染已成为全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。更具严重后果的是该菌与格林一巴利综合征(Guillain-Barr~syndrome,GBS)有非常密切的关系,是导致GBS发生的重要前驱感染原。但是,由于目前对C.jejuni的遗传学特性、毒力因子、致病作用和C.jejuni诱发GBS的机制尚不完全明了,至今仍缺少有效而可行措施来预防C.jejuni腹泻和GBS的发生。为此,本研究针对C.jejuni是一种多变、易变的肠道感染细菌,利用DNA疫苗诱导特异性体液免疫、细胞免疫的优势和壳聚糖增强粘膜吸收、缓释等特性,设计制备了具有高效粘膜免疫应答的C.jejuni多价DNA疫苗。并探讨其在小鼠体内诱导特异性免疫应答的效应和在小鼠C.jejuni攻击模型中的免疫保护力,以及其在应用中的周围神经安全性问题。为深入开发新型C.jejuni疫苗奠定理论基础。课题分四部分: 第一部分 空肠弯曲菌多价DNA疫苗的构建及其表达 目的:利用基因工程技术分别构建C.jejunicadF和peblA基因的真核表达重组质粒,并以此重组质粒DNA为核心,通过壳聚糖包裹DNA,构建C.jejuni多价DNA疫苗。并评价壳聚糖作为DNA疫苗递呈系统,其促进DNA疫苗在真核细胞中表达的有效性和安全性。 方法:⒈重组质粒的构建与鉴定:分别以C.jejuniHS:2、‘HS:8、HS:19和HS:21的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得四种血清型的cadF和peblA基因DNA片段,并测序比较HS:2和HS:19peblA基因的同源性。在此基础上,选择与GBS最为相关的C.jejuniHS:19cadF和peblA基因PCR纯化产物为目的基因DNA片段,分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),以构建pcDNA3.1(+)一cadF和pcDNA3.1(+)一peblA重组质粒。重组质粒经双酶切鉴定、PCR鉴定和DNA双向测序确认。⒉重组质粒在COS-7细胞中表达:以重组质粒DNA为核心,分别采用壳聚糖和PolyFect转染试剂包裹DNA,制备壳聚糖-DNA和PolyFect-DNA,转染COS-7细胞,RT-PCR方法检测其瞬时表达,ELISA检测其在COS-7细胞中的表达产物。⒊MTT法检测壳聚糖-DNA的细胞毒性。 结果:⒈PCR反应显示四种血清型C.jejuni的cadF和peblA基因DNA片段大小一致,DNA双向测序证实C.jejuniHS:19peblA基因序列与HS:2peblA基因序列具有高度同源性。所构建的重组质粒分别经双酶切和PCR鉴定,以及DNA双向测序证实目的基因插入成功。⒉采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。ELISA分析表明在COS一7细胞培养上清中可获得目的基因表达产物。并且,壳聚糖一DNA组与PolyFect-DNA组相比较,其转染效率和表达水平更高,转染后3d,其表达水平增高了5.1倍,PolyFect-DNA组仅增高了2.9倍(P<0.01)。⒊MTT法检测显示,壳聚糖-DNA组与PolyFect-DNA组相比较,其转染细胞存活率更高,转染后3d,壳聚糖-DNA组90%左右的细胞生长良好、形态正常,而PolyFect-DNA组细胞的存活率降至65%左右(P<0.01)。 结论:⒈C.jejunicadF和peblA基因具有高度的保守性,以此成功构建的pcDNA3.1(+)一cadF和pcDNA3.1(+)一peblA重组质粒均能在COS-7细胞中有效表达。⒉壳聚糖-DNA递呈系统是安全、高效的DNA疫苗递呈系统。 第二部分 目的:评价Cjejuni多价DNA疫苗经粘膜免疫后,诱导特异性体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答的效应。 方法:⒈378只6周BALB/c小鼠被分为9个大组,每组42只小鼠。于实验开始的0、7、14和2l天,以未干预组、pcDNA3.1(+)组和壳聚糖组为对照,分别将不同效价的C.jejuniDNA疫苗滴鼻免疫小鼠,包括:pcDNA3。1(+)一cadF和pcDNA3.1(+)一peblA(单抗原裸DNA疫苗)、pcDNA3.1(+)一cadF+pcDNA3.1(+)一peblA(双抗原裸DNA疫苗)、壳聚糖-pcDNA3.1(+)一cadF和壳聚糖-pcDNA3.1(+)一peblA(壳聚糖一单抗原DNA疫苗),以及壳聚糖-pcDNA3.1(+)一cadF+pcDNA3.1(+)一peblA(壳聚糖一双抗原DNA疫苗)。⒉流式细胞计量仪检测末次免疫后4周小鼠外周血CD4+、CD8+T细胞分类情况。⒊ELISA检测末次免疫后2、4、6和8周小鼠血清中细胞因子IFN-7、IL-4和特异性抗体IgA、IgG、IgM水平,以及小鼠粪便中IgA抗体水平。⒋末次免疫后8周各组随机抽取6只小鼠,取其小肠组织行免疫组织化学检查,以观察小鼠肠壁SIgA的变化。 结果:⒈各实验组与各对照组相比较:⑴末次免疫后4周,各实验组小鼠外周血CD4+、CDs+T细胞数有显著性升高(P<0.01);⑵末次免疫后2、4、6和8周,小鼠血清中IFN-~、IL-4和IgA、IgG、Igm水平,以及粪便中IgA水平,与对照组相比较均存在显著性差异(P<0.01),各对照组小鼠血清中上述各项参数一直无变化。各实验组小鼠血清IFN-7、IL-4、IgA、IgG、IgM和粪便IgA水平均从免疫后2周开始上升,4周达顶峰,到第6周和8周时壳聚糖-DNA疫苗组维持在较高的水平(IgM抗体除外),而裸DNA疫苗组则迅速下降;⑶末次免疫后8周,肠壁SIgA免疫组化染色显示,各实验组小鼠其小肠粘膜固有层可见不同程度的棕色颗粒沉着,呈(+)~(+++)反应,而各对照组仅表现为(-)~(土)反应。⒉对应时期各实验组相比较,上述各项指标均以壳聚糖.双抗原DNA疫苗组为最高,壳聚糖一单抗原DNA疫苗组次之,单抗原裸DNA疫苗组最低(P<0.01)。但是,壳聚糖一单抗原DNA疫苗组间比较和单抗原裸DNA疫苗组间比较均无显著性差异(P>0.05)。 结论:C.jejuni多价DNA疫苗经鼻免疫小鼠后,能在小鼠体内激发显著而持久的特异性体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答。 第三部分 空肠弯曲茵多价DNA疫苗的免疫保护性研究 目的:探讨C.jejuni多价DNA疫苗在小鼠C.jejuni攻击模型中的免疫保护力,测试该疫苗的实际有效性。 方法:⒈末次免疫后第8周,分别采用HS:l9或HS:2单次和HS:19重复攻击的方式进行C.jejuni不同严重度的灌胃攻击。⒉实施C.jejuni攻击后,对各种C.jejuniDNA疫苗的免疫保护作用进行比较性评价,包括观测疾病指数以判断疫苗的临床保护效率;大便培养以判断疫苗对C.jejuni肠道定植的清除效应;肝组织匀浆培养以评价疫苗阻止C.jejuni感染向肠道外扩散的效力。⒊C.jejuniHS:19末次重复攻击后第4周,各组随机抽取6只小鼠取其小肠组织,行免疫组织化学检查,以观察肠壁SIgA的同步改变。⒋C.jejuni末次攻击后第4周和12周,取其坐骨神经分别用于原纤维分离检查、半薄切片光镜检查和超薄切片电镜检查以观察疫苗阻止C.jejuni感染诱发周围神经免疫损伤的效力。并取其小肠和肝脏组织进行H&E染色组织病理学检查。 结果:⒈C0ejuni攻击后引起对照组小鼠明显组织病理学异常,包括:⑴小肠组织不同程度的充血水肿、炎性细胞浸润;⑵肝脏组织显示细胞质疏松、气球样变性、点状坏死和灶性坏死,并伴有炎性细胞浸润;⑶坐骨神经组织发生以轴索变性为主的免疫性损伤。⒉各实验组和各对照组在C.jejuniHS:19重复攻击时,其疾病指数、C.jejuni肠道定植率、C.jejuni肠道外(肝脏)感染扩散率和受检器官病变发生率均显著高于HS:19或HS:2单次攻击(P<0.01);HS:19单次攻击时,其坐骨神经病变发生率又明显高于HS:2单次攻击(P<0.01)。⒊与对照组相比,各C.jejuniDNA疫苗均能不同程度地保护免疫后小鼠免遭C.jejuniHS:19重复攻击和HS:2的感染攻击,明显减少C.jeiuni的肠道定植率,有效防止C.jejuni的血行扩散,显著降低受攻击小鼠的疾病指数和受检器官病变发生率(P<0.01)。其中,壳聚糖一双抗原DNA疫苗组的免疫保护作用最强,壳聚糖一单抗原DNA疫苗组次之,单抗原裸DNA疫苗组最低。⒋C.jejuniHS:19重复攻击后第4周,免疫组织化学检测显示小鼠肠壁SIgA呈同步性改变。 结论:⒈C.jejuni重复攻击比单次攻击具有更强的感染致病力,可作为C.jejuni对被免疫动物强化攻击的有效模型。C.jejuniHS:19比HS:2具有更高的致周围神经免疫性损伤的危险性。⒉C.iejuni多价DNA疫苗滴鼻免疫小鼠后,能在小鼠体内激发显著而有效的特异性免疫应答,有效地保护免疫后小鼠抵御C.jejuni重复感染攻击,明显减少该菌在宿主肠道定植和肠道外扩散,显著降低被攻击小鼠疾病指数,并伴有肠壁SIgA同步性分泌增多。⒊C.jejuni多价DNA疫苗在有效抵御C.jejuni肠道感染与扩散同时,还能有效阻止周围神经免疫性损伤发生。
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