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LMP1转基因小鼠构建及功能初步研究
中文名称: LMP1转基因小鼠构建及功能初步研究
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论文编号: 3122161收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Establishing LMP1 Transgenic Mouse and Exploring LMP1 Gene Function in Vivo
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理学与病理生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 鼻咽癌 EB病毒 ED-L2启动子 潜伏膜蛋白1 慢病毒载体 转基因小鼠 转基因技术
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:本研究拟利用本室以ED-L2为启动子构建的LMP1基因慢病毒表达载体:ED-L2-B-LMP1-EGFP和ED-L2-N-LMP1-EGFP,分别以慢病毒感染技术和目的基因显微注射技术构建B-LMP1和N-LMP1转基因小鼠。这两个载体是分别包含全长N-LMP1基因和B95-8-LMP1基因的慢病毒载体,经验证,载体携带的LMP1和EGFP融合蛋白可以在转染细胞中正确表达。本研究在建立转基因动物的基础上,对转基因小鼠细胞生长和增殖的相关因子进行检测,探讨LMP1基因对细胞生长和增殖相关蛋白的影响,揭示LMP1在鼻咽癌的发生发展中的作用,为建立鼻咽癌相关动物模型奠定研究基础。主要研究内容包括: 1.鉴定ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒载体、获得病毒和目的片段; 2.比较不同品系小鼠用于胚胎移植异同,寻找合适的候选转基因小鼠品系; 3.慢病毒感染法和精原核显微注射法分别建立LMP1转基因小鼠; 4.比较转基因小鼠和正常对照小鼠PCNA、TGF-a、EGF和EGFR表达的异同。 方法1.ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒表达载体酶切鉴定,转染293FT细胞观察荧光表达,收获pED-L2-B-LMP1-EGFP病毒; 2.分别以KM小鼠与B6CF1(C57BL/6雌鼠和BALB/C雄鼠杂交F1代)小鼠作为受体鼠和供体鼠,分析比较其胚胎移植成功率的差异; 3.采用ED-L2-B-LMP1-EGFP慢病毒受精卵透明带内注射和注射后受精卵回种技术,建立ED-L2-B-LMP1-EGFP转基因小鼠; 4.分别应用ED-L2-B-LMP1-EGFP和ED-L2-N-LMP1目的DNA显微注射及受精卵回种技术,建立ED-L2-B-LMP1-EGFP和ED-L2-N-LMP1转基因小鼠; 5.应用PCR、SouthernBlot、免疫组化和组织染色技术及PCR产物测序,鉴定转基因小鼠目的基因的整合效果; 6.应用免疫组化检测和分析转基因小鼠的PCNA,TGF-a,EGF和EGFR表达情况。 结果 1.ED-L2-N-LMP1-EGFP慢病毒载体酶切鉴定 1.1重组ED-L2-N-LMP1-EGFP慢病毒载体经PacI/BamHI双酶切后,可见8687bp的载体片段(包含EGFP片段)、3600bp的LMP1片段及782bp的ED-L2启动子片段,和理论上各条带大小一致; 1.2载体质粒经PacI/EcoRI双酶切,获得7968bp载体片段(不包含ED-L2和EGFP片段)和ED-L2-N-LMP1-EGFP目的片段(5101bp); 1.3载体质粒经PacI/KpnI双酶切,获得三条带,分别为7887bp载体片段(不包含EGFP片段)、ED-L2-N-LMP1目的片段(4382bp)和EGFP(约800bp);胶回收纯化ED-L2-N-LMP1片段,-20℃保存用于转基因显微注射。 2.重组ED-L2-B-LMP1-EGFP慢病毒载体酶切鉴定 2.1载体PacI/BamHI酶切鉴定,可见8687bp载体、1300bpB-LMP1和782bpED-L2片段; 2.2PacI/EcoRI双酶鉴定获得7968bp载体片段和2801bpEDL-2-B-LMP1-EGFP片段; 3.ED-L2-N-LMP1-EGFP和ED-L2-B-LMP1-EGFP质粒分别载体转染293FT包装细胞,48h后倒置荧光显微镜下均可观察到绿色荧光蛋白表达。 4.对小鼠品系比较显示,B6CF1小鼠作为供体鼠和受体鼠的胚胎移植成功产仔率明显高于KM鼠; 5.慢病毒感染技术建立转基因小鼠结果:对412枚受精卵注射带目的基因ED-L2-B-LMP1-EGFP的慢病毒,回种226枚,共移植入19只假孕鼠,5只回种假孕鼠产仔,共产仔16个,即受体鼠产仔率为26%,受精卵回种产仔率为7%; 6.精原核显微注射技术建立转基因小鼠结果:用ED-L2-B-LMP1-EGFP目的片段注射受精卵874枚,回种卵545枚,共移植入41只假孕鼠,9只回种假孕鼠产仔,共产仔35个,即受体鼠产仔率为22%,受精卵回种产仔率为6%;用ED-L2-N-LMP目的片段注射受精卵224枚,回种卵146枚,共移植入9只假孕鼠,3只回种假孕鼠产仔,共产仔25个,即受体鼠产仔率为33%,受精卵回种产仔率为17%。 7.PCR、SouthernBlot、免疫组化和组织染色技术结合PCR产物测序,鉴定证明慢病毒感染法建立1只ED-L2-B-LMP1-EGFP转基因阳性小鼠;DNA显微注射技术建立4只ED-L2-B-LMP1-EGFP转基因首建鼠(阳性率为11%),其F1代ED-L2-B-LMP1-EGFP转基因小鼠有2只LMP1基因阳性,而且SouthernBlot阳性小鼠LMP1基因表达也为阳性,主要呈上皮定位,表达部位包括鼻咽部上皮、皮肤表皮、胃肠道柱状上皮、肾脏小管上皮、腮腺上皮细胞和神经节内神经细胞细胞,肝脏则以少量枯否氏细胞和少量肝细胞散在阳性。转基因小鼠鼻咽部鳞状上皮细胞层数增加,主要表现为基底细胞及棘细胞增生,上皮脚下延,基底细胞及基底上棘细胞轻度异型。25只ED-L2-N-LMP1F0代转基因小鼠有12只为PCR阳性,免疫组化显示其LMP1表达与ED-L2-B-LMP1-EGFP转基因定位基本一致。 8.免疫组化检测B-LMP1转基因小鼠的PCNA,TGF-a、EGF和EGFR表达显示,与对照小鼠比较,转基因小鼠的PCNA表达强于对照小鼠;而TGF-a、EGF和EGFR基本上仅在转基因小鼠体内表达,对照小鼠体内该三种蛋白基本上没有表达或仅有弱表达;PCNA,TGF-a、EGF和EGFR在转基因小鼠体内的表达主要定位于鼻咽部、皮肤、胃肠道、肾脏、脑组织和肝脏等的相应上皮细胞。 结论 1.成功构建ED-L2-B-LMP1-EGFP转基因和ED-L2-N-LMP1两种转基因小鼠; 2.LMP1转基因小鼠PCNA,TGF-a、EGF和EGFR表达增强: 3.TGF-a、EGF和EGFR表达增强可能是LMP1基因促进细胞增殖的路径之一。
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