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急性分离大鼠下丘脑神经元自发性放电触发机制研究
中文名称: 急性分离大鼠下丘脑神经元自发性放电触发机制研究
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论文编号: 3122151收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Mechanisms of Spontaneous Firings of Acutely Dissociated Neurons in Rat Hypothalamus
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 细胞生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 下丘脑 神经元 自发放电 HCN通道 单细胞RT-PCR 急性分离 大鼠
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论文简介:研究背景 细胞温度敏感机制是目前环境生命科学研究的热点之一。近年来围绕温度敏感的分子感受和调控机制,研究者从多个方面进行了探索,包括钾通道、瞬时受体电位通道、氨基酸类受体(包括谷氨酸受体和γ-氨基丁酸受体)、内生阿片样受体、ATP受体蛋白等都有参与,这些分子主要参与对细胞放电幅度和频率、对周围系统的产热和散热系统进行调节。但总的来说,目前对于这些调控分子的研究还处于起步阶段,可能还存在一些关键的调控分子尚未得到重视或发现。下丘脑,特别是视前区/前部下丘脑(Preopticandanteriorhypothalamus,PO/AH)中的神经元参与了多种机体活动,例如温度调控、饮食行为等等,在众多的功能之中,其作为机体感受温度变化并调控相应反应的中枢器官尤其为人们所重视及认同。 可改变神经元动作电位时程的因素均有参与神经元的温度敏感机制形成的可能性,例如超极化激活环核苷酸门控离子通道(hyperpolarization-activated,cyclicnucleotide-gatedchannels,HCNchannel)可由细胞膜电位的超极化而激活,造成胞外Na+及K+内流,从而使膜电位有去极化的趋势,进而影响细胞AP。加上下丘脑中表达有HCN通道的事实,使得对下丘脑温度敏感机制的研究又增添了新的线索。 下丘脑对于机体温度感受及调节的重要性早已获得公认,然而由于下丘脑组织含有种类繁多、性质各异的神经元,加上各种神经元之间相互的作用,使得在整体动物及脑片上进行的实验研究涉及到太多的影响因素及作用机制;而另一方面,亦有研究人员对培养状态下的下丘脑PO/AH神经元电生理特性及温度敏感性进行了研究,但是培养状态下的细胞面对着与体内截然不同的内环境,其细胞性状及特性还有基因表达等等均会产生或多或少的改变,因此从培养神经元获得的实验资料并不能准确地反映其在体内真实性状。因此有必要对急性分离的下丘脑神经元电生理特性进行研究,以使人们对下丘脑的认识更加全面。 HCN通道功能的纷繁复杂,不同种类细胞中HCN通道的特性也各不相同,变化多端,相当多的研究已揭示下丘脑组织区域表达有丰富的HCN通道,然而对下丘脑神经元的电生理特性中HCN通道的功能却少有研究涉及。 目的 1.探讨急性分离的大鼠下丘脑神经元自发放电特性以及其温度敏感性。 2.研究HCN通道各亚型mRNA在相应单个自发放电神经元中的表达情况。 3.探索下丘脑神经元的温度敏感内在机制以及其与HCN通道之间的联系,从而为下丘脑温度感应及调控机制研究找到新的线索。 方法 1.利用酶消化下丘脑脑片及机械分离方法获得急性分离的神经元,为后继实验提供状态良好的神经元。 2.采用全细胞模式膜片钳记录大鼠下丘脑神经元的自发放电活动及Ih电流,明确其电生理特性并施加温度影响。 3.采用单细胞RT-PCR技术检测前述电生理实验确定的各类型神经元中HCN通道mRNA的表达情况,并利用限制性内切酶酶切反应来验证PCR产物的特异性 结果 1.利用酶消化下丘脑脑片及机械分离方法可成功获得急性分离的神经元,神经元状态良好,可保证后继实验的准确性。 2.在总共记录的78个下丘脑神经元之中,共记录到12个自发放电的神经元,其余均为非自发放电神经元。二者膜电容及输入阻抗无显著差异(P>0.05)。 3.下丘脑神经元的自发放电可以由自发去极化或前电位(包括EPSP)触发,可据此将自发放电的神经元分为两类,即自发去极化神经元(spontaneousdepolarizingneuron,SDN)和前电位驱动神经元(prepotential-drivenneuron,PPDN)。 4.SDN与PPDN静息膜电位及输入阻抗无显著差别,而PPDN突触后电位(post-synapticpotential,PSP)发生的频率则显著高于SDN(P<0.05)。 5.下丘脑神经元动作电位呈时间依赖性的衰减,可能与采用全细胞记录模式有关。由于这种模式通常破坏了细胞膜的完整性,随着记录时间的延长,胞内成分逐渐与电极内液交换,这就造成了胞内离子成分被电极内液替代,这可能是动作电位时间依赖性衰减的最大原因。 6.下丘脑中对温度敏感及不敏感的SDN和PPDN均有存在。 7.注射电流的大小对EPSP驱动神经元的放电频率及幅度基本不会产生影响;对SDN放电频率有影响,注射电流越大,单位时间内神经元放电频率增加,但幅度降低。注射电流对SDN和EPSP驱动神经元放电峰电位亦有影响,SDN峰电位随着放电次数增加而降低,而EPSP驱动神经元峰电位无明显变化。 8.全细胞模式下自发放电大鼠下丘脑神经元上可记录到Ih电流,应用特异的HCN通道阻断剂ZD7288可将ZD7288敏感电流分离出来;而Ih的降低可导致IA增强。 9.ZD-7288阻断Ih电流后不同类型神经元放电产生了不同变化,反映了Ih电流在神经元温度敏感机制中的作用。ZD7288可降低自发去极化的WSN放电频率及电位幅度,阻断EPSP驱动的WSN自发放电,而对自发去极化及EPSP驱动的TIN无显著影响。利用SC-RT-PCR方法在每类神经元中均检测到了HCN1、HCN2、HCN3mRNA的表达,但未检测到HCN4mRNA。进一步的限制性内切酶反应亦证实了SC-RT-PCR的特异性。 结论 1.急性分离的大鼠下丘脑神经元根据其放电触发机制可分为前电位驱动神经元及自发去极化神经元两类。 2.全细胞模式下大鼠下丘脑神经元上可记录到Ih电流,而Ih的降低可导致IA增强,从而可改变放电频率。 3.电生理实验提示HCN通道参与了下丘脑神经元自发放电过程,而单细胞RT-PCR亦证实上述下丘脑热敏神经元中表达有HCN1、HCN2及HCN3三种亚型的mRNA分子。
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