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大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞的实验研究
中文名称: 大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞的实验研究
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论文编号: 3122133收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Research of Differentiation of Mesenchymal Stem Cells into Hepatocyte-like Cells in Rat
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 骨髓间充质干细胞 分离培养 免疫组化 电镜 肝细胞生长因子 表皮细胞生长因子 移植
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论文简介:研究背景 目前,肝炎、感染、创伤、肿瘤等引起的晚期终末肝衰竭的患者越来越多,对于肝衰竭或肝功能支持替代方法成为临床的一大难题。现在的临床治疗方法包括肝脏移植、肝细胞移植、肝脏干细胞移植。其中原位肝移植是治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病、代谢性肝病最为有效的方法,但是由于其供体来源极其有限,技术要求高,经济费用大,很难满足众多患者需要,许多患者在痛苦的等待中死亡。肝细胞移植也开展了数十年,其操作简单,价格便宜,曾经颇为流行,但由于其供体缺乏和免疫排斥反应问题而影响到进一步的发展。肝脏干细胞是近几年研究的热点,由于其来源于自体而没有移植后的免疫排斥反应,是合适的肝脏损伤后肝衰竭的移植物并有望成为一种新的临床方法。但经过研究发现,肝脏本身干细胞的数量极其微少,并且其在体外增殖较为困难,限制了这个研究的发展前景。 骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,MSCs)在一定条件下可以定向分化成为某种成体干细胞、成体细胞或者横向分化为多种组织细胞的潜力被证实了,因而备受人们关注,又有研究发现:它可能是肝脏干细胞的来源之一,也有证据表明MSCs在肝脏损伤的修复中起到非常重要的作用。在此过程中,MSCs的分离、培养和性质鉴定等方面的研究取得了一定进展。骨髓干细胞是成体干细胞中的主要来源部分,它主要由间充质干细胞与造血干细胞组成。造血干细胞在胚胎早期具有分化成内、中、外三个胚层的潜能,以后进一步分化为血系细胞、肌、肝、肺、肾、小肠、皮肤等。它主要存在于骨髓、外周血和脐带血中,可分化为各种血细胞使血液细胞成分得到不断补充,是体内各种血细胞的唯一来源。临床上,造血干细胞移植技术已经成为治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病、多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。伴随造血干细胞的研究进展,MSCs是最近几年被发现的,它可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、心肌细胞、肝细胞和神经元等。由于MSCs可以向多个胚层、各种组织细胞分化,并且可以通过温和的机械方法获得,故研究其分离培养的方法、进行分化调控,以及培养成为肝细胞具有发展前景,因此它能否最终解决肝脏损伤后肝衰竭的移植物问题成为近来的热点. 研究目的 本实验旨在探讨一种操作简单、费用低廉、结果可靠的大鼠MSCs分离培养方法,为体外增殖提供一种可行的途径。对分离的大鼠MSCs进行体外多细胞因子调控,促使其向有功能的肝细胞分化。对肝损伤模型进行经过诱导的MSCs同种大鼠移植,观察其对损伤肝脏可能的修复作用、探讨修改机制。 本实验研究意义:各种原因引起的肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏损伤疾病的治疗一直是一个全球性难题,骨髓干细胞移植治疗血液系统疾病已积累了几十年的临床经验,而其作为肝基因治疗的细胞载体具有肝细胞不可替代的优势,不仅在于可以替代肝细胞移植,而且还可以在早期即可利用骨髓修复肝脏损伤,并为干细胞工程、肝组织工程提供相应的实验及理论依据。随着人们对MSCs横向分化机制认识的逐步深入,MSCs将替代成熟肝细胞而成为肝细胞移植或体外人工肝脏的一种新来源,将为以上各种原因引起的肝损伤开拓新的治疗途径。 研究方法 1.直接贴壁法分离纯化MSCs,进行体外传代,用免疫细胞化学和流式细胞技术鉴定其性质,用核染技术研究其DAPI和BrdU的标记,流式细胞技术进行细胞周期检测。 2.HGF联合EGF对体外培养的MSCs诱导分化,用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射和扫描电镜形态学照相,细胞免疫组化、RT-PCR对诱导分化后的细胞进行鉴定。检测诱导分化后MSCs分泌尿素及摄取靛青绿的功能。 3.制造大鼠肝损伤模型,BrdU标记上述诱导与未诱导的MSCs,经门静脉移植至同种D-氨基半乳糖损伤的大鼠,通过血生化检测受体肝功能,组织学、组织免疫组化、组织电镜等方法对移植后的MSCs追踪,评估肝脏修复情况。 上述方法具体内容和过程如下: 1.MSCs分离和鉴定:无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用改良冲洗法抽出骨髓,用直接贴壁法分离纯化MSCs,体外扩增、传代。取第3代行细胞爬片,用抗CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD14、CD34、CD45行免疫细胞化学检查,同时流式细胞技术鉴定它们的定量表达。DAPI和BrdU对分离的MSCs标记,流式细胞技术对分离的MSCs行周期检测。 2.诱导MSCs与鉴定:取上述第3代的MSCs,分为实验组和对照组,实验组按照实验第一部分获得大鼠MSCs,以细胞浓度2×105/ml,接种培养,实验组为特级胎牛血清内添加20ng/mlHGF+10ng/mlEGF培养诱导的MSCs。 3.肝脏损伤的修复:D一氨基半乳糖腹腔注射复制大鼠肝脏损伤模型(400mg/kgD-gal,使大鼠的受到肝脏中等程度的损伤),分为实验组和对照组,实验组向损伤的大鼠门静脉移植用BrdU标记的HGF联合EGF诱导后的MSCs培养液1ml(每毫升培养液中含细胞数105),对照组用BrdU标记的未诱导MSCs同浓度剂量对模型行门静脉移植,分别在1、3、7、14天进行抽血查生化(丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST、总胆红素TBi)、切片行常规病理、组织免疫组化法检测CK18、CD34、OV6、BrdU阳性细胞分布迁移情况、透射电镜观察移植后汇管区新增生细胞超微结构,评价类肝细胞在体内移植及修复肝功能结果。 研究结果 1.体外培养的原代MSCs72小时内可见贴壁细胞,7天左右达到汇合,传代后,细胞免疫组化法显示MSCs的CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性,流式细胞仪检测其阳性率分别为64.36%、86.73%、90.21%、74.25%、54.60%;而CD14、CD34、CD45表达阴性,阳性率分别为0.19%、0.17%、0.18%。DAPI标记效率高达100%,BrdU标记率达98%以上,均是较好的标记方法。细胞周期检测结果显示:第3代MSCs中G0/G1期的细胞为89.43%(大约为36-57道),G2期的细胞为2.82%(大约在两倍道86-112道),S期的细胞为7.65%。只有少数细胞处于活跃的增殖期,大部分细胞处于静止期,符合干细胞特征。 2.HGF联合EGF对体外培养的MSCs进行诱导分化:倒置相差显微镜观察显示:实验组诱导培养的MSCs逐渐向类肝细胞形态转变,由刚开始的梭型,变为椭圆型、类圆形,增殖速度减慢,而对照组细胞的形态基本不变。细胞免疫组化鉴定:Alb和AFP蛋白染色,与对照组阴性结果比较,实验组Alb第3天即呈阳性表达,AFP蛋白染色第7天阳性表达。显微荧光观察:实验组MSCs的FITC-AFP为绿色荧光,RPE-Alb为红色荧光。RT-PCR检测:与对照组比较,实验组MSCs细胞的Alb、AFP、CK-18的mRNA都有一定表达,其中AFP的mRNA在第7天阳性表达,14天最强,21天开始减弱,Alb及CK-18第三天即有表达,21天均最强。透射电镜显示:未诱导MSCs具有幼稚细胞的结构特点。 3.诱导MSCs经门静脉移植修复肝脏结果:分别于1、3、7、14天处死大鼠,ALT、AST、TBi三项肝功指标均明显异常,两组均出现逐步下降的趋势(实验组/对照组:ALT:335.67±15.08→45.20±5.89/347.67±22.26→78.00±2.16IU/L。AST:265.33±15.37→45.00±6.04/267.83±8.80→77.25±6.99IU/L。TBi:7.18±0.37→3.45±0.18/7.60±0.49→4.81±0.23mol/L),但在同时间段内,实验组下降幅度更大。经过统计学分析,三项指标在两组间有显著差异(F=206.84,P=0.000),同组内不同时间之间有显著差异(F=14.289,P=0.000)。说明实验组与对照组对于肝脏功能的保护作用是有差异的,证明了诱导分化的类肝细胞具有修复肝脏功能的作用。组织切片显示:实验组肝细胞变性坏死程度明显轻于对照组,尤以7、14天更明显,免疫组化示BrdU标记的骨髓间充质干细胞随时间延长,逐渐由门脉区向肝内移动,组织免疫组化检测:两组均出现CK18、CD34、OV6阳性细胞结果;与对照组比较,实验组阳性细胞明显增多,形成大量的胆小管,并有部分向坏死区迁移。透射电镜显示:与对照组比较,实验组有新生内源性细胞,小于成熟的肝细胞,细胞器较少,有细胞紧密连接,以数个细胞排列成小胆管,与组织免疫化学检查结果一致。 研究结论 1.本实验表明直接贴壁法分离MSCs简单、易行,对分离的MSCs活性影响较小,值得推广。MSCs能在体外较容易分离培养和扩增,为体内、外研究MSCs提供了很好的来源。BrdU和DAPI标记MSCs敏感性均好,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,为细胞移植打下良好的基础。 2.本实验结果显示HGF联合EGF可以诱导MSCs在体外向类肝细胞分化,在实验设置的时间段第7天,可检测到肝细胞标志物和功能表达;形态上在21天更成熟,成为类肝细胞,具有内质网、线粒体、糖原颗粒。 3.本实验将HGF联合EGF诱导后的MSCs移植给受损伤的肝脏,发现其能在一定程度上修复肝脏的损伤,并能激发内源性的卵圆细胞增生,协同恢复损伤的肝功能。对于肝移植、肝细胞移植、肝脏干细胞移植方法上的不足和缺陷,可能会对各种原因的肝损伤患者提供一种新的探索思路。
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