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菲立磁标记恒河猴骨髓源性神经干细胞自体移植磁共振在体研究
中文名称: 菲立磁标记恒河猴骨髓源性神经干细胞自体移植磁共振在体研究
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论文编号: 3122131收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: In Vivo Magnetic Resonance Tracking of Feridex Labeled Bone Marrow-derived Neural Stem Cells after Autologous Transplantation in Rhesus Monkey
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 神经外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 骨髓基质细胞 神经干细胞 菲立磁 超顺磁性氧化铁 磁共振成像 恒河猴 自体移植
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论文简介:研究背景 干细胞是指有多种分化潜能和自我更新能力的细胞,这种多潜能细胞存在于成年个体的许多组织和胚胎中。许多研究已经证明哺乳动物脑内的干细胞或祖细胞在生理或病理状态下都具有很强的迁移和分化能力,实行干细胞替代治疗能够有效地重建缺损的组织功能,是一种很有前途的临床治疗策略。 基于以上原因,如果能够在合适的示踪剂帮助下,采用无创伤性影像学技术来在体识别、跟踪移植后骨髓基质细胞的存活状态及与宿主神经组织整合情况并科学评价疗效,将大大提高骨髓基质细胞移植疗法的学术价值。最新研究显示核磁共振造影剂—葡聚糖修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒已经成功在体外用于多种细胞的标记,从而为我们提供了利用核磁共振活体动态监测干细胞在脑内迁移的可能。 第一章恒河猴骨髓基质细胞体外分离培养和诱导分化的实验研究 目的:探索神经干细胞培养基和细胞因子对恒河猴骨髓基质细胞体外分离、增殖和诱导分化的影响。 方法:无菌条件下行髂骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获取大鼠骨髓基质细胞。原代培养第3天后,实验组利用神经干细胞培养基和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF),进行体外培养、诱导、增殖。对照组用神经干细胞培养基进行培养增殖。同时观察胎牛血清和维甲酸(RA)对细胞的诱导作用。利用倒置相差光学显微镜追踪观察细胞生长情况并计数和拍照。利用抗神经巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原性纤维酸性蛋白免疫细胞化学方法对骨髓基质细胞分化后的神经干细胞、神经元和神经胶质细胞分别进行特异性鉴定。 结果:倒置相差显微镜观察发现,初接种的细胞为悬浮状态,呈圆形,细胞边缘完整、光滑。接种后的10h内,骨髓基质细胞开始贴壁,72h后贴壁细胞不再增多。更换培养基后,可见较纯的贴壁细胞,72h换液去除非粘附细胞后,可见剩余的粘附细胞有三种形态:大而扁平的成纤维细胞样细胞、中等大小的圆形细胞/卵圆形细胞和小的圆形细胞。对照组细胞在原代培养第6天时有少许细胞克隆团形成,培养第10天时细胞数量明显开始增多,可见到岛屿状细胞克隆团的形成。 加入bFGF+LIF的实验组细胞,24h后可见中等大小的圆形细胞有显著的细胞分裂相。培养第6天时可见到许多细胞克隆团形成,培养8d细胞数量开始显著增多,可见到岛屿状细胞克隆团的形成。至第12天时,可见大量克隆团形成,细胞几乎爬满培养板底部。LIF组或bFGF组细胞生长情况与bFGF+LIF组细胞类似,增殖细胞总数不如前者,但与对照组相比细胞数量显著增多(F=4737.953,P<0.001)。 原代培养第5天时实验组和对照组多数细胞阳性表达神经干细胞特异性抗原—神经巢蛋白(Nestin)抗原,证实已经形成骨髓基质细胞源性神经干细胞(BMSCs-D-NSCs)。胎牛血清和RA诱导后,BMSCs-D-NSCs能分化出神经元样细胞和胶质细胞样细胞,免疫细胞化学检测可见有神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结论:实验结果表明,恒河猴骨髓基质细胞是多分化潜能的细胞,具有较强的自我更新能力和多分化能力。在合适的培养条件下,骨髓基质细胞可以快速扩增,并可以向神经干细胞、神经元、神经胶质细胞等方向分化。因此,恒河猴骨髓基质细胞可以考虑作为修复中枢神经系统损害细胞移植治疗的种子细胞之一。 第二章菲立磁标记恒河猴骨髓基质细胞的细胞生物学研究 目的:利用在体神经影像学追踪干细胞在脑内的移植无疑能够帮助我们正确评价移植细胞对功能恢复的调节情况。菲立磁(Feridex)是一种超顺磁性氧化铁,可以作为磁共振成像(MRI)的对比造影剂,临床上已经被用于肝脏成像。本研究旨在初步探索利用菲立磁和转染试剂多聚赖氨酸体外磁性标记恒河猴骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像追踪标记细胞奠定基础。 方法:无菌条件下取恒河猴骨髓,梯度密度离心法分离获取恒河猴骨髓基质细胞,使用“菲立磁-多聚赖氨酸复合物”标记骨髓基质细胞。采用普鲁士兰染色和透射电镜对细胞内铁和标记效率进行检测,利用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞形态学变化,菲立磁标记骨髓基质细胞与神经元联合培养检测菲立磁的细胞渗漏性,采用四唑盐(MTT)实验鉴定菲立磁标记骨髓基质细胞的活力。应用流式细胞仪、荧光染色和透射电镜分别对细胞周期及细胞凋亡情况进行分析,采用免疫细胞化学方法和TRAP-ELISA法分别对标记后骨髓基质细胞的分化、增殖能力和端粒酶表达进行测定评估。 结果:细胞内铁的鉴定:普鲁士蓝染色显示菲立磁-多聚赖氨酸(FE-PLL)复合物标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL复合物标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。 细胞形态学观察:倒置相差显微镜下不同培养阶段标记组和未标记组BMSCs相比较,两者之间细胞形态无明显差异。扫描电镜下可见不同培养阶段标记组和未标记组BMSCs相比较,两者之间细胞形状和大小无明显差异,未标记组BMSCs表面相对光滑,而标记组细胞表面可见细小的铁颗粒附着。 渗漏性检测:FE-PLL复合物标记干细胞与大脑皮层神经元共培养后,Prussianblue染色显示标记干细胞为阳性,未标记大脑皮层神经元内呈阴性,说明FE-PLL复合物标记后细胞内Fe不会渗漏到细胞外被其它细胞摄取。 FE-PLL复合物对细胞活力的影响:MTT结果显示,标记细胞与未标记细胞相比,吸光度值无显著性差异(F=0.579,P=0.457),说明FE-PLL复合物对细胞活力没有明显的影响。 FE-PLL复合物对细胞周期的影响:流式细胞仪结果显示,FE-PLL标记组细胞G1/G0、S、G2/M期的细胞所占百分比和正常未标记组细胞相比,两者没有显著性差异(F=0.001,P=0.973),说明FE-PLL标记对细胞周期没有明显的影响。 FE-PLL复合物对细胞端粒酶表达和活性的影响:TERT免疫细胞化学染色显示,可见对数生长期的标记细胞和未标记细胞都呈阳性反应,胞质内可见棕黄色的阳性颗粒。酶联免疫检测仪检测,标记组和正常组相比,OD值没有显著性差异(F=591.091,P<0.001)。 FE-PLL复合对细胞增殖或分化的影响:在含FE-PLL复合物的培养基中BMSCs可继续增殖和分化,细胞形态没有发生明显的变化。BMSCs增殖分裂和分化后普鲁士蓝染色仍为阳性,增殖分裂后的BMSCs细胞质内铁颗粒数量较增殖前变少。 FE-PLL对细胞凋亡的影响:荧光显微镜下,Hoechst33258核染色结果显示,FE-PLL标记后培养不同时间的标记细胞和相同时间点的未标记细胞,绝大多数细胞核形态正常,呈圆形或椭圆形,淡蓝色荧光。标记细胞和未标记细胞都可见到少数细胞发生凋亡现象,即胞核致密亮蓝色浓染,或呈碎块状致密浓染。电镜下绝大多数标记细胞和正常细胞超微结构形态正常。流式细胞仪检测显示,FE-PLL标记组细胞和正常组细胞随着培养时间的延长细胞凋亡有增加的趋势,但相同时间点两组细胞相比差异不显著性(F=0.921,P=0.340)。 结论:FE-PLL复合物可以用来体外标记恒河猴骨髓基质细胞。应用FE-PLL复合物标记恒河猴骨髓基质细胞安全、有效。 第三章菲立磁标记恒河猴骨髓基质源神经干细胞自体移植入纹状体后活体磁共振示踪和形态学观察 目的:将体外菲立磁标记的骨髓基质细胞经单细胞悬液微移植后,观察其在恒河猴纹状体的存活、迁移、分化和整合状况,为细胞移植治疗疾病奠定基础。 方法:分离恒河猴骨髓基质细胞,利用神经干细胞培养基、白血病抑止因子和碱性成纤维细胞生长因子进行细胞扩增并诱导成骨髓基质源神经干细胞,再经体外菲立磁和活细胞荧光染料PKH67标记后,采用微移植的方法,通过脑立体定位仪用微玻璃针将干细胞分别植入脑纹状体内。细胞移植后1,4,8周应用核磁共振成像对脑内移植的细胞进行活体示踪,最后利用光镜和电镜观察标记细胞在脑内的形态学情况。 结果:体外菲立磁和PKH67标记结果:普鲁士蓝染色显示99%以上的Feridex标记的骨髓基质细胞细胞质内出现细小的蓝色铁颗粒;PKH67处理2h后,经荧光显微镜检查99%以上的骨髓基质细胞胞膜都被绿色荧光标记。 磁共振检查:术后第1,4及8周分别行核磁共振成像检查,SET1WI序列可见左侧移植FE-PLL标记干细胞的纹状体区域可见信号轻度升高,SET2WI、FSET2WI和GRET2*WI序列检查纹状体区域则呈现不同程度的低信号改变,右侧未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变。T2WI扫描序列信号较T1WI明显,其中GRET2*WI序列低信号相对下降明显。 组织学检查:镜下观察表明细胞移植局部无明显的组织损伤,很容易发现移植部位存活的细胞。左侧移植区内,显微镜下普鲁士兰染色显示标记细胞胞浆呈蓝色染色,荧光显微光。细胞移植1,4,8周时的组织学改变基本上与核磁共振影像相对应。 透射电镜观察:移植后1,4和8周在Feridex标记和宿主神经元之间未观察到有突触样结构,但移植后4和8周可见标记细胞的突起伸向宿主神经元突起或胶质突起,两者之间形成接触。 结论:骨髓基质源神经干细胞移植后,可在脑内存活、迁移、分化和整合,利用核磁共振成像技术可以对移植后脑内的标记细胞进行初步活体追踪。
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