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肺癌甲状腺转录因子-1基因突变及表达规律研究
中文名称: 肺癌甲状腺转录因子-1基因突变及表达规律研究
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论文编号: 3122111收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Mutational Analysis of Thyroid Transcription Factor-1 Gene and Investigation on Its Expression in Lung Carcinoma
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 肺癌 甲状腺转录因子-1 免疫组化 原位杂交 阳性单位 聚合酶链反应-单 链构象多态性 变性高效液相色谱 免疫酶斑点法
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论文简介:背景与目的 肺癌对人类健康的危害日益严重,从20世纪中叶开始,肺癌的发病率与死亡率在全世界范围内迅速增长。但至今对肺癌尚缺乏有效的早期诊断、早期治疗手段。深入研究与肺癌发生、发展相关的因子对于肺癌的早期诊断、复发和转移的早期发现、疗效的监测以及预后判断具有重要的意义。 甲状腺转录因子-1(ThyroidTranscriptionFactor-1,TTF-1)是近年来发现的一个新的分子标记物,选择性地表达于不同发育时期甲状腺、肺及脑组织部分区域,与这些器官的组织发生、功能维持、肿瘤发生及其他相关疾病的发生关系密切。 以往对肺癌中TTF-1表达的研究为定性观察,探讨了TTF-1在不同类型肺癌中的表达情况,但其表达的量化特点及基于量化改变的变化规律、其在肺癌淋巴结转移灶中的表达状况(包括定性及定量研究)以及影响其表达的核酸分子生物学机制等均未见报道。 随着分子生物学的进展,人们对肿瘤的发生机制在分子水平上有了更新的认识,基因研究越来越受到重视。从分子水平研究TTF-1基因与肺癌发生、发展的关系有助于深入揭示肺癌的发病机制。TTF-1基因突变是否与肺癌的发生发展有关有待进一步的研究。 早期发现、早期诊断是提高肺癌治疗效果的关键。血清TTF-1蛋白在肺癌患者中有无变化或其变化有何特点及规律,对肺癌的诊断和检测分析有无价值尚待研究。 因此,本研究拟探讨TTF-1蛋白及mRNA在肺癌、正常成人肺和胚胎肺组织中的表达,揭示TTF-1在不同节段支气管中的分布特点及与肺癌来源的关系定量测试肺癌患者血清TTF-1蛋白的表达强度及变化规律,探讨血清TTF-1蛋白对于肺癌的诊断价值,为阐明肿瘤标志物(TM)在肺癌诊断中的价值提供辅助依据。 方法 1.收集2002-2005年间石蜡包埋正常成人肺组织和15例胚胎肺组织,病理活检196例石蜡包埋肺癌组织及98例相应石蜡包埋淋巴结转移癌组织。从TTF-1与患者性别、肿瘤大体类型、分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期之间的关系对肺癌进行分析。 2.采用组织微阵列技术,构建正常成人肺组织、胚胎肺组织、肺癌组织和相应淋巴结转移癌的石蜡组织芯片。 3.采用免疫组织化学技术检测1320点阵组织芯片上TTF-1蛋白在不同类型肺组织中的表达情况。应用LeicaQ500MC图像分析系统测试TTF-1蛋白的阳性单位(PU)值,分析不同类型肺组织中TTF-1蛋白表达强度的变化规律及与肺癌的关系。 4.采用原位杂交技术检测1320点阵组织芯片上TTF-1mRNA在不同类型肺组织中的表达情况。应用LeicaQ500MC图像分析系统测试TTF-1mRNA的阳性单位(PU)值,分析不同类型肺组织中TTF-1mRNA强度的变化规律及与肺癌的关系。 5.用组织显微切割技术刮取肺癌组织实质,用于组织DNA提取。对经PCR-SSCP检测出有异常电泳条带改变和经DHPLC检测出现杂合双峰的DNA片段进行测序,确定突变类型,分析基因功能改变。 6.收集与石蜡包埋肺癌组织相匹配的肺癌患者血清标本,健康体检者血清标本,肺部良性病变患者血清标本,肺外肿瘤患者血清标本。应用免疫酶斑点(Dot-Enzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-Elisa)法检测血清标本中TTF-1蛋白的表达情况,应用LeicaQ500MC图像分析系统结合阳性单位测试方法定量测试血清标本中TTF-1蛋白的表达强度,分析血清TTF-1蛋白的变化规律,揭示血清TTF-1蛋白在肺癌诊断中的辅助作用。 结果 1肺的腺癌、鳞癌和大细胞癌淋巴结转移灶中癌细胞核TTF-1的PU值均大于其癌原发灶癌细胞核TTF-1的PU值;肺小细胞癌淋巴结转移灶癌细胞核TTF-1的PU值略大于其原发灶癌细胞核TTF-1的PU值。有淋巴结转移的肺癌原发灶癌细胞核TTF-1的PU值大于无淋巴结转移的肺癌原发灶癌细胞核TTF-1的PU值;TNMⅡ-Ⅳ期癌细胞胞核TTF-1蛋白的PU值大于Ⅰ期;癌细胞胞核TTF-1蛋白的PU值与肺癌分化程度(肺腺癌;肺鳞癌:P和患者性别无关;TTF-1蛋白的PU值与肺癌大体类型之间的关系不明显。 2肺小细胞癌淋巴结转移灶中癌细胞胞浆TTF-1mRNA的表达强度与其原发灶中癌细胞胞浆TTF-1mRNA的表达强度基本相同(P=0.078);有淋巴结转移组肺癌癌细胞胞浆TTF-1mRNA的表达强度大于无淋巴结转移组TTF-1mRNA的表达强度(P=0.026);TNM分期U-Ⅳ期肺癌癌细胞胞浆TTF-1mRNA的PU值大于TNMⅠ期(P=0.010);肺癌癌细胞胞浆TTF-1mRNA的表达强度与患者性别(P=0.694)、肿瘤大体类型(P=0.149)和肺癌分化程度(肺腺癌:P=0.774;肺鳞癌:P=0.217)无关。 3.肺癌组织和相对应的正常肺组织中TTF-1基因外显子1区引物1A、1S所扩增片断a均未出现电泳迁移率的改变,11例肺癌组织外显子2区引物2A、2S所扩增片断b出现明显电泳迁移率的改变,另有5例肺癌组织外显子2区引物2A、2S所扩增片段b出现可疑电泳迁移率的改变,3例肺癌组织外显子2区引物3A、3S所扩增片断c出现可疑电泳迁移率的改变。发现TTF-1基因外显子1区扩增片段a洗脱峰均表现为单峰。 发现11例为TTF-1基因1741位点碱基G转换为碱基C,1例为TTF-1基因1742位点碱基G转换为碱基C,使其编码的氨基酸由GGG[甘氨酸(Gly,G)]转变为GGC[甘氨酸(Gly,G)],3例为TTF-1基因1742位点碱基G转换为碱基T,使其编码的氨基酸由GGG[甘氨酸(Gly,G)]转变为GGU[甘氨酸(Gly,G)]。经DHPLC检测,92例肺癌组中15例出现杂合双峰改变(16%),92例正常对照肺组织均未检测出异常移动的单链DNA电泳条带或杂合双峰,与肺癌组相比较,差异具有统计学意义(P=0.000)。TTF-1基因突变率与肺癌患者性别、大体类型、分化程度、淋巴结转移与否和TNM分期无关。15例TTF-1基因突变病例在蛋白水平和mRNA水平上的表达一致。 4.应用Dot-Elisa法结合图像定量分析技术及阳性单位测试方法对与肺癌组织标本相匹配的55例血清样本进行检测并进行定量测试。肺腺癌、肺鳞癌、肺小细胞癌、肺大细胞癌和甲状腺癌血清TTF-1蛋白的PU值均大于其癌组织匀浆TTF-1蛋白的PU值(P=0.000);肺癌组织匀浆和血清TTF-1蛋白的PU值与肺癌患者TNM分期有关(P=0.000),与性别、肿瘤大体类型、分化程度和有无淋巴结转移均无关。 5.正常成人肺组织中,主支气管及终末细支气管以上的细支气管上皮细胞胞核TTF-1表达阴性(100%),终末细支气管以下的细支气管上皮细胞胞核和肺泡Ⅱ型上皮细胞胞核TTF-1表达阳性(100%),肺腺癌细胞胞核TTF-1表达阳性(83%),肺小细胞癌细胞胞核TTF-1表达阳性(71.4%);肺鳞癌细胞胞核TTF-1阳性表达率为10%;肺大细胞癌细胞胞核TTF-1阳性表达率为18.2%。 结论 1.TTF-1蛋白的表达量在正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞、胚胎肺泡上皮细胞和肺癌细胞核中的表达具有差异性并依次减少;肺癌细胞核TTF-1蛋白的表达具有癌组织类型差异性,腺癌和小细胞癌相对较高,鳞癌和大细胞癌极少;TTF-1胞核高表达的肺癌易发生转移,TTF-1蛋白胞核高表达的肺的腺癌、鳞癌和大细胞癌癌细胞可作为判断该肺癌细胞具有明显转移能力的重要标志之一。 2.TTF-1mRNA的表达强度在正常成人肺泡Ⅱ型上皮细胞、胚胎肺泡上皮细胞和肺癌癌细胞中具有差异性并依次减少;肺癌癌细胞TTF-1mRNA的表达具有癌组织类型差异性,腺癌和小细胞癌相对较高,鳞癌和大细胞癌极少;TTF-1mRNA高表达的肺癌易发生转移,TTF-1mRNA高表达的肺的腺癌、鳞癌和大细胞癌可作为判断该肺癌细胞具有明显转移能力的重要标志之一。 3.肺癌组织中存在TTF-1基因错义突变和同义突变,发生在TTF-1基因1741和1742位点,突变频率为16%,这一突变可能与部分肺癌的形成有关。肺癌组织中TTF-1基因突变与TTF-1蛋白和mRNA表达不足有关。TTF-1基因错义突变、同义突变及其蛋白和mRNA表达不足的分析可作为肺癌分子病理学分析的重要指标。 4.Dot-Elisa法结合图像定量分析技术及阳性单位测试方法用于检测血清TTF-1敏感、特异、可靠,适于血清中TTF-1蛋白的检测。在排除甲状腺癌之外,血清TTF-1对于肺癌的检测具有辅助作用。 5.TTF-1阳性的肺腺癌细胞可能有一部分来源于TTF-1阳性的终末细支气管以下的细支气管上皮细胞或肺泡Ⅱ型上皮细胞;细支气管肺泡癌可能主要来源于肺泡H型上皮细胞;包括粘液型肺腺癌在内的TTF-1阴性的肺腺癌细胞可能主要来源于终末细支气管以上的细支气管上皮细胞。大多数肺鳞癌细胞和肺大细胞癌细胞的来源与肺泡Ⅱ型上皮细胞或TTF-1阳性的终末细支气管以下的细支气管上皮细胞无明显的直接关系。
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