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HIV的噬菌体核酸疫苗的制备及其初步应用研究
中文名称: HIV的噬菌体核酸疫苗的制备及其初步应用研究
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论文编号: 3122098收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Construction of HIV DNA Vaccine Based on Lambda Phage-vector and a Study of Its Preliminary Application
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 人类免疫缺陷病毒 包膜糖蛋白gp120基因 包膜糖蛋白gp41基因 核心蛋白gag基因 绿色荧光蛋白 基因表达 λ噬菌体疫苗 核酸疫苗
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论文简介:人类免疫缺陷病毒是引起艾滋病的病原体,分为两型,HIV-1和HIV-2,HIV-1在全球范围传播广泛,是艾滋病流行的主要病原体。目前,人类免疫缺陷病毒感染的流行尚处于早期阶段,在未来的二十年内,全世界HIV感染率会明显升高。 近年来对亚单位疫苗、多肽疫苗、减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组病毒载体疫苗及核酸疫苗等多种不同的HIV候选疫苗进行了大量的研究。人们对核酸疫苗寄予厚望,其最大的优点是疫苗抗原在靶细胞内以天然的方式合成、加工并呈递给免疫系统,可以诱发机体产生强大的体液和细胞免疫应答包括Th应答和CTL应答,并且其保护性免疫应答对不同亚型的病毒具有交叉抵御作用。近年来,HIV核酸疫苗主要针对HIV外膜蛋白基因,这种疫苗可以诱导出较强的细胞免疫应答和体液免疫应答。当前,HIV核酸疫苗主要针对较为保守的HIV核心结构蛋白和调节蛋白基因。这些蛋白核苷酸序列在不同的HIV-1毒株中变异性较小,而这些蛋白在HIV的生命周期和HIV感染致病性中起着重要作用。 常用的核酸疫苗的载体有质粒、腺病毒和牛痘病毒等。最近噬菌体介导的DNA疫苗的出现,恰恰克服了这些核酸疫苗的缺陷,噬菌体不但具有生产工艺简单、制备快速容易、自然条件下储存比较稳定(4C稳定保存至少6个月)、在宿主的真核组织中不能复制、避免了抗生素携带和可通过口服途径呈递抗原等优点,而且能够容纳较大的外源片段(长达23Kb)和多个疫苗基因,因此这类疫苗将成为以后几年内研究的热点。 为了开发HIV-1流行毒株的噬菌体核酸疫苗,本实验进行了三个方面的研究,分别如下: 1.HIV-1B亚型候选基因(gp120、gp41、gag)及绿色荧光蛋白基因(gfp)在原核细胞中的表达及其多克隆抗体的制备。 以HIV-1B亚型U26942全基因DNA质粒及重组质粒pUC18/gfp为模板进行PCR,扩增出gp120、gp41、gag及gfp基因,再将这些基因与pMD18-T连接,构建重组克隆质粒。经双酶切和DNA序列分析鉴定后,用相应的酶对基因重组正确的克隆进行酶切,将所得目的基因插入到质粒pET28b(+)相应的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28b(+)/gp120、pET28b(+)/gp41、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp,进行酶切鉴定和DNA序列分析。用基因重组鉴定正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,诱导产物用SDS-PAGE电泳进行分析。利用Ni-NTAagarose对表达蛋白进行纯化,用所获得的重组融合蛋白及其纯化产物免疫家兔,制备兔抗HIVgp120、gag及gfp多克隆抗血清。结果示:对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,可见在1.44Kb、1.04Kb、1.5Kb、0.7Kb处有明显的条带,与预期扩增的gp120、gp41、gag及gfp基因长度相符;对重组克隆质粒pMD18-T/gp120、pMD18-T/gp41、pMD18-T/gag及pMD18-T/gfp进行双酶切鉴定,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,在1.44Kb、1.04Kb、1.5Kb、0.7Kb处发现明显的条带,与预期连接的基因片段相符,DNA序列分析结果与相应的基因序列一致,表明目的基因已被正确克隆,质粒构建成功;重组表达质粒pET28b(+)/gpl20、pET28b(+)/gp41、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,诱导产物用SDS-PAGE电泳进行分析,与空白对照相比较在分子量55.4kDa(gp120)、57.5kDa(gag)和29.9kDa(gfp)发现明显蛋白带,而gp41没有表达,Westernblot证实重组蛋白可以与抗组氨酸单克隆抗体发生免疫反应;目的蛋白经Ni-NTAagarose进行纯化,用所获得的重组融合蛋白及其纯化产物免疫家兔,制备了兔抗HIVgp120、gag及gfp多克隆抗血清。 2.HIV-1B亚型候选基因(gp120、gp41、gag)及绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达。 克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120、gp41基因和核心蛋白gag基因以及绿色荧光蛋白基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制各自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗及其阳性对照奠定基础。以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA及pUC18/gfp作为模板,根据Genbank中gp120、gp41基因和核心蛋白gag基因的核苷酸序列及绿色荧光蛋白的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增包膜糖蛋白gp120、gp41基因和核心蛋白gag基因以及绿色荧光蛋白基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含包膜糖蛋白gp120、gp41和核心蛋白gag以及绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gp120、pcDNA3.1(+)/gp41、pcDNA3.1(+)/gag及pcDNA3.1(+)/gfp。 3.HIV噬菌体疫苗的制备及其免疫学特性研究。 构建好的含有HIV核心蛋白gag基因的噬菌体在大肠杆菌Y1088中进行扩增,然后进行纯化、浓缩,即过夜感染的培养物先用DNA酶和RNA酶进行处理,加入氯化钠,离心去掉细胞碎片,噬菌体颗粒再用聚乙烯已二醇沉淀,然后离心,重悬沉淀,加入氯仿提取液,液相进行超速离心,从而得到较纯的含有HIV核心蛋白gag基因的噬菌体,用噬菌体缓冲液多次洗涤后可以储存于4C备用。8-10周龄C57小鼠,体重20g左右,随机分成两组,每组8只。实验组:肌肉注射含gag基因的噬菌体疫苗100μl/只(2μg);对照组:肌肉注射噬菌体缓冲液100μl/只。在14天、28天时同样剂量加强免疫,42天时取血,用Westernblot法检测特异性抗HIV-1gag抗体,结果发现gag的位置上有特异性的目的条带,说明含有gag基因的重组噬菌体免疫小鼠可以诱导特异性的体液免疫应答,初步验证了用噬菌体作为核酸疫苗载体的可行性。因此,噬菌体核酸疫苗价格便宜,制备工艺简单,高效,并且能够容纳较大的外源片段(长达23Kb)和多个疫苗基因,这种全新简易的核酸疫苗制备策略将会越来越广泛的得到推广应用。 总之,本研究成功构建了重组表达质粒pET28b(+)/gp120、pET28b(+)gp41、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp;pET28b(+)/gp120、pET28b(+)/gag及pET28b(+)/gfp可高效表达目的蛋白;纯化后的目的蛋白制备了多克隆抗体。另外,还构建了HIV-1B亚型候选基因(gp120、gp41、gag)及绿色荧光蛋白基因的真核表达载体,并且观察了其在真核细胞中的表达。最后,制备了噬菌体核酸疫苗,免疫结果表明含有gag基因的重组噬菌体免疫小鼠可以诱导特异性的体液免疫应答,为我们进一步制备口服的噬菌体疫苗奠定了基础。
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