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RelB基因沉默对骨髓树突状细胞生物免疫学功能的影响研究
中文名称: RelB基因沉默对骨髓树突状细胞生物免疫学功能的影响研究
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论文编号: 3122067收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Effect of RelB Gene Silencing on the Bioimmunological Function of Bone Marrow Dendritic Cells
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 骨髓 树突状细胞 免疫耐受 RNA干扰 核转录因子NFκB/RelB 小鼠 骨髓细胞
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论文简介:目的: 树突状细胞(dendriticcell,DC)具有激活免疫应答或诱导免疫耐受的功能,未成熟状态的树突状细胞倾向于诱导免疫耐受产生,被称为“致耐受DC(tolerogenicdendriticcell,TolDC)”。我们在成功建立体外扩增高纯度小鼠骨髓树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcell,BM-DC)方法的基础上,利用最新的RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)针对DC成熟的NFκB依赖途径中关键基因—RelB基因,筛选出最佳的siRNAPCR表达框序列,用于构建RelB基因沉默的RNAiRelBDC,并从细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫功能等方面对RNAiRelBDC的生物免疫学特性进行了比较研究,以期构建出RelB基因沉默的全新致耐受DC--RNAiRelBDC,验证其诱导T细胞免疫耐受特性及可能机制,为其成功用于治疗移植排斥反应及自身免疫性疾病提供可靠的理论和实验依据。 方法: 1、骨髓DC的体外培养与鉴定研究: 分离C57BL/6小鼠骨髓前体细胞,在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rmIL-4)刺激下,手法筛选并结合CD11c+免疫磁珠分选方法,培养扩增骨髓来源DC(BM-DC),并通过细菌脂多糖(LPS)刺激诱导DC成熟。 2、树突状细胞RelB基因沉默及效果检测研究: 根据siRNA设计原则预先设计3段RelBsiRNA序列,采用美国绿阳公司PCR表达框试剂盒,构建出相应的3种RelBsiRNA表达框(R1/siRNA、R2/siRNA、R3/siRNA),转染体外培养的未成熟DC。实验分为六组:⑴Control-DC组;⑵LPS-DC组;⑶R1/siRNA转染组:用R1/siRNA转染未成熟DC;⑷R2/siRNA转染组:用R2/siRNA转染未成熟DC;⑸R3/siRNA转染组:用R3/siRNA转染未成熟DC;⑹GFP/siRNA转染组:用GFP/siRNA转染未成熟DC,也即本实验的阴性对照组)。采用RT-PCR和细胞免疫荧光方法分别在mRNA水平和蛋白质水平检测比较各组DC的RelB基因表达情况,筛选出RelB基因沉默效果最好的有效siRNA序列。 3、RelB基因沉默对树突状细胞的生物免疫学功能影响研究: 在成功构建RNAiRelBDC基础上,实验分成四组:⑴Control-DC组;⑵LPS-DC组;⑶RelB基因沉默组(RNAiRelB-DC):第4天经过RelBsiRNA处理的培养第6天的DC;⑷LPS刺激的RelB基因沉默组(LPS-RNAiRelB-DC):第4天经过RelBsiRNA处理和结束前加入外源性LPS(1μg/ml)刺激24h的培养第6天收集的DC。 结果: 1、在rmGM-CSF和rmIL-4诱导下,可从小鼠骨髓培养扩增出大量DC,每两只小鼠获得BM-DC约1~2×107个,完全满足实验需要。单纯手法筛选,BM-DC中CD11c阳性率达70%以上,若结合CD11c+免疫磁性细胞分选方法,可将阳性率提高至90%以上。 2、Control-DC组细胞形态多为圆形,皱褶多,突起较少,细胞器也少,但胞内较多吞饮泡,细胞表型检测MHCⅡ类分子低水平表达,共刺激分子低表达(CD40、CD86等),细胞分泌IL-12水平较低,MLR表明该类DC刺激同种异基因T细胞增殖能力较弱,表现出未成熟DC的特点。 3、PCR表达框方法可以得到设计好的针对RelB基因3个不同位点的RelBsiRNA,可用于骨髓未成熟DC的转染实验。RT-PCR显示,与另外两个位点相比,R2/siRNA可以明显抑制细胞RelB基因表达(P<0.001);细胞免疫荧光分析结果也显示R2/siRNA可以明显减弱RelB蛋白表达水平。 4、RNAiRelBDC形态为圆形或椭圆性,胞内有大量囊泡结构,部分囊泡可见吞噬的异物,细胞核多偏向一侧,溶酶体和线粒体等细胞器少,表面突起少,形态较规则;细胞表达MHC-Ⅱ类分子、CD40、CD86等表面分子较低。 5、RNAiRelBDC刺激T细胞增殖能力较Control-DC还弱,其中当T/DC比例为10:1和5:1时,两组间差异有显著性(P值分别为0.037和0.003);LPS刺激后RNAiRelBDC刺激T细胞增殖能力未见明显增高,与LPS-DC组DC的MLR能力差异仍有显著性(P<0.001)。 6、RNAiRelBDC分泌IL-12的能力显著低于LPS-DC,二者差异有显著性(P<0.001),而与Control-DCIL-12的表达水平接近。LPS-RNAiRelB-DC的表达IL-12的水平略高于RNAiRelBDC组,但与LPS-DC组也存在显著性差异(P<0.001)。 7、RNAiRelBDC与Control-DC和LPS-DC相比,显著抑制T细胞分泌IL-2(P值均<0.001)和IFN-γ(P值分别为P<0.001和P=0.016)。四组细胞分泌IL-4、IL-10未见明显差异,RNAiRelBDC显示较强的分泌IL-4、IL-10的能力。 8、RNAiRelBDC和LPS-RNAiRelBDC诱导CD4+CD25+调节性T细胞生成比例与LPS-DC相比显著增加(P值均小于0.001),RNAiRelBDC诱导调节性T细胞生成能力较Control-DC强,差异具有显著性(P=0.028)。 结论: 1、小鼠骨髓前体细胞在rmGM-CSF和rmIL-4诱导下,可扩增到大量的DC。 2、手法筛选结合CD11c阳性细胞免疫磁珠分选方法可以得到90%以上纯度的DC,适合应用于DC的分子免疫学研究。 3、R2/siRNAPCR表达框转染DC可以在mRNA和蛋白质水平明显抑制细胞RelB基因表达,不影响细胞活力和形态,是最佳的候选siRNA靶位点,适合用于构建RNAiRelBDC。 4、RNAiRelBDC为圆形或椭圆性,胞内有大量囊泡结构,表面突起少,与未成熟DC形态结构相似。 5、RNAiRelBDC细胞表达MHC-Ⅱ类分子、CD40、CD86等表面分子相对较低,MLR显示较弱的刺激T细胞增殖能力。 6、RNAiRelBDC低水平分泌IL-12,MLR反应中诱导Th0向Th2细胞偏倚,IL-2和IFN-γ分泌抑制,IL-10和IL-4分泌相对占优势,同时诱导CD4+CD25+调节性T细胞大量生成。 7、RNAiRelBDC在细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫学功能等方面与未成熟DC相似,具有致耐受DC特性,有望用于治疗移植排斥反应及自身免疫性疾病的防治。 主要创新点: 1、建立简便、相对经济的体外大规模扩增高纯度骨髓树突状细胞培养方法。改良Inaba建立的经典树突状细胞体外扩增方法,采用培养第2天手法筛选结合培养第6天CD11c免疫磁珠分选方法,成功建立稳定、简便、相对经济的大量扩增高纯度骨髓来源DC的培养方法,每两只小鼠骨髓可扩增得到1~2×107个DC,CD11c阳性率达到90%以上,具有典型的DC形态和功能特点,完全适合DC功能的分子生物学研究需要。 2、首次采用RNA干扰技术特异性沉默DC成熟关键基因RelB基因的表达。本研究采用siRNAPCR表达框方法,在预选设计的3个siRNA靶位点(1027、302和1121,分别表示为R1/siRNA、R2/siRNA和R3/siRNA)中,通过转染后DCRelB基因在mRNA和蛋白表达水平的比较研究,首次成功获得R2/siRNA为有效的RelB基因特异性沉默位点。目前国内外未见类似报道。 3、首次构建出RelB基因沉默DC(RNAiRelBDC),并从细胞形态、细胞表面分子表达、细胞免疫学功能等方面研究了RNAiRelBDC的生物免疫学功能特性,初步证实RNAiRelBDC由于RelB基因被有效沉默,表现为未成熟DC的形态和功能特点,不能被LPS刺激其成熟,是一种全新的致耐受DC,有望应用于移植免疫耐受诱导和自身免疫性疾病生物治疗。目前国内外未见类似报道。 4、首次描述RNAiRelBDC生物学和免疫学功能特点为:细胞形态为圆形或椭圆形,胞内大量囊泡结构,细胞器较少,细胞表面突起少,与未成熟DC具有相似的形态结构。细胞表面低表达MHC-Ⅱ、CD40、CD86等分子,混合淋巴细胞反应(MLR)中显示较弱的刺激异基因T细胞增殖的能力,细胞分泌IL-12水平较低,MLR反应中诱导Th0向Th2细胞偏倚,Th1细胞因子(IL-2和IFN-γ)分泌抑制,Th2细胞因子(IL-10和IL-4)分泌相对占优势,同时诱导CD4+CD25+调节性T细胞大量生成。RNAiRelBDC生物免疫学特性的阐明对RNAiRelBDC的后续完善和临床应用打下基础。目前国内外未见类似报道。
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