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印迹基因在人类种植前胚胎及卵巢上皮癌中的研究
中文名称: 印迹基因在人类种植前胚胎及卵巢上皮癌中的研究
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论文编号: 3122062收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: The Study of Imprinted Genes in Human Preimplantation Embryos and Epithelial Ovarian Cancer
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 妇产科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 印迹基因 种植前胚胎 辅助生殖 遗传性印迹病 LOTI ARHI 卵巢癌 甲基化
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论文简介:基因印迹是依靠单亲传递某些遗传学性状的现象,即某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达,另一等位基因不表达或表达极弱。具有这种现象的基因被称为印迹基因。传统的孟德尔遗传规。目前已经明确的印迹基因大约有60个左右,通常成簇存在,由印迹中心控制,印迹调控中心的突变性失活可导致多个印迹基因异常表达,产生遗传性印迹综合症。 辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology,ART)做为不孕治疗的重要手段已在世界范围内广泛开展,在西方国家大约1%~3%出生婴儿来自辅助生殖。 第二部分 1、在正常卵巢组织中,LOT1和ARHI基因均呈半甲基化状态,证实二者均属于印迹基因,双亲来源等位基因的差异甲基化作用参与了其印迹形成,即正常情况下一条等位基因呈甲基化状态,而另一条等位基因呈非甲基化状态 2、在卵巢上皮癌中,LOT1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态,抑制了该基因的表达,即除正常印迹沉默的等位基因外,另一条有功能的等位基因也因甲基化作用沉默,导致抑癌作用下降、诱发卵巢上皮癌。 3、卵巢上皮癌组织中印迹抑癌基因ARHI启动子及编码区的3个CpG岛存在甲基化异常,抑制了该基因的表达,导致抑癌作用下降,可能是卵巢上皮癌发病环节之一。 4、本研究证实在卵巢上皮癌中,两条抑癌印迹基因LOT1和ARHI表达下调的原因均是甲基化异常,提示甲基化异常可能同时干扰多条印迹抑癌基因,降低其抑癌能力,是卵巢上皮癌的发病机制之一。 许多印迹基因具有原癌或抑癌基因的功能,并有其特点: 1、传统的肿瘤二次突变学说指出:原癌或抑癌基因必须接受两次打击,使两个等位基因同时受到激活或抑制才会发生肿瘤。印迹基因相当于功能上的单倍体,仅需一次打击就能诱发肿瘤,增加了肿瘤易感性及显性突变的危险性。 2、基因印迹产生及其调控最可能的机制是DNA差异甲基化,即双亲之一的等位基因失活是通过由亲代来源决定的DNA富含CpG区(CpG岛)的甲基化作用实现的。DNA甲基化属于表观遗传学修饰,仅从转录水平调控DNA功能,不涉及基因结构的改变。证明许多理化因素可以扰乱甲基化模式,导致印迹基因功能紊乱,使个体患癌的可能性增加。 3、印迹基因常成簇存在,由印迹中心控制,印迹调控中心的突变性失活可导致多个印迹的原癌和抑癌基因异常表达。 4、印迹改变是肿瘤发生中的前期事件,使患者发生肿瘤的易感性增高。从而提示印迹基因作为肿瘤标记物发挥筛查和监测作用的可能性。 印迹基因及其甲基化修饰在诱发肿瘤过程中的独特性引起广泛关注,成为肿瘤领域新的研究热点。卵巢上皮癌(Epithelialovariancancer,EOC)是妇科最常见的恶性肿瘤之一其卵巢上皮癌的发病机制和诊治一直是妇科肿瘤领域的研究重点。 本课题的目的就是寻找与卵巢上皮癌特异相关的印迹基因,并对其甲基化修饰在卵巢上皮癌中的作用加以研究,为开发应用甲基化抑制剂等新方法治疗卵巢癌提供理论基础。 LOT1基因是1997年在卵巢上皮细胞体外培养自发恶化过程中被发现的,在此过程中其表达丢失,因而被称为LOT1基因(lostontransformation1)。LOT1基因是印迹抑癌基因,做为锌指核转录因子,具有诱导凋亡、抗增殖能力,在邻近启动子区有密集的CpG岛,CpG岛的甲基化修饰导致其母源性等位基因印迹沉默。 ARHI基因为母系印迹失活的抑癌基因,对于机体生长和发育起负向调节作用,DNA序列包括三个CpG岛,参与其印迹形成,岛Ⅰ、Ⅲ有助于ARHI表达的丢失。 目的 研究某些功能特异性印迹基因在人类卵子和种植前胚胎中的表达及其生物学意义,探讨ART与遗传性印迹疾病和肿瘤的关系,并为开展种植前遗传学诊断奠定基础。 方法 种植前胚胎来自经IVF/ICSI-ET治疗后已出生健康儿、自愿捐献多余冻存胚胎的患者,选取无遗传病家族史的夫妇。应用细胞裂解、cDNA制备以及单细胞巢式PCR技术,选择性检测了BWS相关印迹基因P57KIP2、LIT1、TSSC3 结果 1.P57KIP2基因表达于卵子、2细胞、4细胞、8细胞胚胎及囊胚中 2.LIT1基因自8细胞胚胎开始表达,持续至囊胚期 3.TSSC3基因于卵子及各期种植前胚胎中均未表达 4.4细胞、8细胞胚胎、囊胚及卵子中均可测到GRB10基因正常表达 5.除4细胞胚胎未见表达外,卵子和其余各期胚胎均可测得ARHI基因表达 6.LOT1基因自卵细胞开始表达,维持表达于整个种植前胚胎 7.PEG3基因表达于4细胞、8细胞胚胎和囊胚 结论 1.证实BWS相关印迹基因P57KIP2表达于整个人类种植前胚胎,LIT1表达于8细胞胚胎及囊胚期,提示ART某些环节有可能干扰二者的印迹形成和维持、导致BWS发病率增高,并为利用种植前遗传学诊断技术阻断BWS的发病提供了理论依据 2.证实SRS候选印迹基因GRB10存在于人类4细胞、8细胞胚胎、囊胚及卵子中,提示ART某些环节有可能干扰其印迹形成和维持、导致SRS发病率增高,并为利用种植前遗传学诊断技术剔除GRB10基因异常的胚胎、阻断SRS的发病提供了理论依据 3.抑癌印迹基因ARHI、LOT1、PEG3也开始表达于人类种植前胚胎的不同阶段,其印迹形成和维持有可能受ART技术干扰,诱发神经胶质瘤、胚胎性肿瘤或葡萄胎等相关癌症,必需密切随访ART出生儿、监测肿瘤发病率是否增高。 第二部分印迹基因在卵巢上皮癌中的表达及甲基化研究 1.LOT1基因在卵巢上皮癌中的表达和甲基化研究 目的是研究卵巢上皮癌中印迹抑癌基因LOT1mRNA表达及其启动子区CpG岛甲基化状态,以探讨印迹基因LOT1及其甲基化修饰在卵巢癌发病机制中的作用,为开发应用甲基化抑制剂等新方法治疗卵巢癌提供理论基础。 标本分为两组:正常卵巢组30例卵巢上皮癌组30例 结果所有正常卵巢组织中均有LOT1mRNA表达,LOT1/G3PDH平均值为1.00±0.16;卵巢上皮癌组织中LOT1/G3PDH平均值为0.76±0.39,其中18例表达明显减弱或缺失,有统计学差异,P<0.01。29例正常卵巢组织同时扩增出LOT1的甲基化和非甲基化产物,呈半甲基化状态,仅1例只扩增出甲基化产物,呈高甲基化状态。 结论 1.正常卵巢组织中LOT1基因呈半甲基化状态,证实LOT1属于印迹基因,2条等位基因的差异甲基化作用参与了其印迹形成,即正常情况下LOT1一条等位基因呈甲基化状态,而另一条等位基因呈非甲基化状态。 2.在卵巢上皮癌中,LOT1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态,抑制了该基因的表达,即除正常印迹沉默的等位基因外,另一条有功能的等位基因也因甲基化作用沉默,导致抑癌作用下降。提示LOT1基因启动子区的过度甲基化作用可能是卵巢上皮癌发病机制之一。由于甲基化异常是可逆的,由此为开发应用甲基化抑制剂等新方法治疗卵巢癌提供了理论基础。 2.ARHI基因在卵巢上皮癌中的表达和甲基化研究 目的 旨在研究卵巢上皮癌组织中印迹抑癌基因ARHImRNA表达及其3个CpG岛甲基化状态,以探讨ARHI基因及其甲基化修饰在卵巢上皮癌发病机制中的作用,了解甲基化异常对印迹抑癌基因影响的普遍程度。 方法 标本分为两组:正常卵巢组20例卵巢上皮癌组20例 提取组织总RNA,采用RT-PCR方法检测ARHI基因mRNA表达;采用DNA亚硫酸盐修饰、PCR扩增及甲基化敏感性限制性内切酶方法检测ARHI基因3个CpG岛的甲基化状态,内切酶TagⅠ用于检测CpGⅠ和Ⅲ,BstUI用于检测CpGⅡ。 结果 1.20例正常卵巢组织中ARHI/G3PDH平均值为0.73±0.09;卵巢上皮癌组织中二者平均值为0.43±0.37,其中8例表达缺失,有统计学差异,P<0.01。 2.20例正常卵巢组织的3个CpG岛均同时扩增出ARHI甲基化和非甲基化产物,呈半甲基化状态 3.20例卵巢癌的3个CpG岛则存在不同比例的甲基化异常,其中6例(30%)CpGⅠ高度甲基化,8例(40%)CpGⅡ高度甲基化,5例(25%)CpGⅢ高度甲基化,1例卵巢癌在CpGⅡ仅发现未甲基化 结论 1.正常卵巢组织中ARHI基因呈半甲基化状态,进一步证实ARHI属于印迹基因,3个CpG岛的差异甲基化作用参与了其印迹形成,即正常情况下ARHI一条等位基因呈甲基化状态,另一条等位基因呈非甲基化状态。 2.卵巢上皮癌组织中印迹抑癌基因ARHI启动子及编码区的3个CpG岛存在甲基化异常,抑制了该基因的表达,导致抑癌作用下降,可能是卵巢上皮癌发病机制之一。由于甲基化异常是可逆的,由此为开发应用甲基化抑制剂治疗卵巢癌提供了理论基础。 3.本研究证实在卵巢上皮癌中,两条抑癌印迹基因LOT1和ARHI表达下调的原因均是甲基化异常,提示甲基化异常可同时干扰多条印迹抑癌基因,降低其抑癌能力,是卵巢上皮癌的发病机制之一。应用甲基化抑制剂可以同时激活多条印迹抑癌基因,使其重新表达发挥抑癌作用,研制特异性甲基化抑制剂是卵巢上皮癌一项有前景的治疗策略。
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