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不同转移潜能大肠癌细胞形态和基因表达谱的差异分析
中文名称: 不同转移潜能大肠癌细胞形态和基因表达谱的差异分析
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论文编号: 3122045收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Differential Analysis of Gene Expression Profiling and Morphology of Human Colorectal Cancer Cells with Different Metastatic Potentiality
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理学与病理生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 大肠癌 基因表达谱 形态学 生物信息学 免疫组织化学 不同转移潜能 细胞形态
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论文简介:基因芯片又称DNA芯片,是最先研究也是较为成熟的一种生物芯片,以高通量、高灵敏度、并行检测为特点,在大肠癌及其它恶性肿瘤中应用广泛。通过基因芯片构建肿瘤相关基因表达谱,研究肿瘤相关基因和转移相关基因在肿瘤发生、发展过程中的功能,揭示肿瘤发生、发展和转移的规律,为肿瘤病原、病因、病理学研究,各种肿瘤的临床诊断、治疗药物筛选、预后判断、治疗效果监测甚至肿瘤预防等领域的研究开辟了广阔的前景。本文主要对基因芯片技术在大肠癌转移研究中的应用进行综述。 结肠癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,目前大肠癌的治疗手段和患者的预后虽然有了较大的改善,但术后局部复发与继发的的淋巴道转移、肝转移仍是严重威胁患者生命的主要因素[1-2]。肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤的、肿瘤细胞与宿主相互作用的过程。在其转移的每一步都涉及多个分子的相互作用以及不同基因在DNA或RNA水平上的一过性或永久性变化。因此,对转移相关基因进行克隆和功能分析,不仅有利于阐述大肠癌转移的分子机理,而且还有望为临床诊治、药物筛选和预后判断寻找新的靶点。基因芯片的出现,克服了传统的基因检测方法(如Southernblot,Northernblot和RT-PCR)费时、费力及针对基因数目少等诸多缺点,实现对靶基因信息的快速、自动化、批量化的检测,获得不同基因在表达上的相关性并通过生物信息学方法对表达谱检测数据进行挖掘,从整体空间上把握与肿瘤发生、发展和转移相关的基因及其表达、调控模式,推测和分析其生物学功能,筛选出肿瘤诊断、预后的分子标志物及治疗的靶基因,具有大规模、高效率的特点。本文主要对基因芯片技术在大肠癌转移研究中的应用进行综述。 1基因芯片概述 肿瘤转移是一个极其复杂、多步骤的、肿瘤细胞与宿主之间相互作用的过程,它涉及到原发肿瘤组织上异质细胞亚群的选择,肿瘤细胞粘附和运动性、抵御机体免疫杀伤、血管生成等多种肿瘤细胞的生物学行为。肿瘤转移发生的过程中,肿瘤细胞的基因调控发挥着主导作用,转移相关基因的表达和调控的结果是转移表型的出现和细胞形态的变化。深入对肿瘤转移异质性的机制研究,确定肿瘤的转移潜能及其相关因素对判断预后、指导治疗、提高患者生活质量具有十分重要的意义。 相同遗传背景、不同转移潜能的细胞系可以排除和减低相关的实验干扰,通过比较细胞形态、生物学特性、表达基因及蛋白差异等,可以确定肿瘤转移相关基因和蛋白,成为肿瘤转移研究不可多得的理想模型。 本课题选择具有相同遗传背景的3个大肠癌细胞系(SW620、SW480和SW480/liver)作为研究对象,我们前期的裸鼠原位移植实验己证实,3个细胞系分别具有不同转移的生物学特性,SW620细胞具有较高的淋巴结转移的选择性,而SW480细胞的异质性较强,易形成广泛的淋巴道、血道转移和种植转移,SW480/liver是本实验室是从SW480细胞系中筛选获得的具有高选择肝转移潜能的亚系。我们以SW480为参照母系,通过比较SW620、SW480/liver两者之间形态学和基因表达谱的差异,探讨它们在大肠癌转移中作用及其相互关系。主要研究内容和结果如下: 一、不同转移潜能不同的大肠癌细胞形态结构的差异分析 不同转移潜能的癌细胞存在膜表面分子种类和数量等的差异,其超微结构的形态也必然存在或多或少的差异,为了解肿瘤细胞形态结构与转移潜能是否存在相关性,我们在对3株大肠癌细胞系进行形态和表面超微结构观测的同时,应用免疫组化检测了Fascin、PCNA、CEA、CD44等的表达。由于肿瘤细胞与基质黏附可影响细胞的形态,我们采用多聚赖氨酸包被的玻片和无任何处理载波片作为培养细胞的附着物,使黏附对细胞的形态影响减低到最小程度。 二、不同转移潜能大肠癌细胞基因表达谱检测及转移相关基因的筛选 基因芯片技术是功能性基因研究的重要手段,能够高通量、高效率、低消耗地对生物学信息进行快速分析处理,大规模的获取相关生物信息,筛选癌症发生、发展可能的相关基因,使研究能够在基因组水平上以系统的、全局的观念去研究分析肿瘤发病和转移机制。 基于Affymetrix芯片的可靠性,采用HG-U133Plus2.0原位合成寡核苷酸芯片对SW620、SW480和SW480/liver细胞3个样品的基因表达谱进行了检测,以求从整体基因水平研究大肠癌转移器官趋向性的作用机制。 三、大肠癌细胞基因表达谱生物信息学分析 大肠癌转移部位主要是淋巴结和肝脏,这种亲器官的转移机制尚未完全明了,也是目前研究的热点。通过对筛选的差异表达基因的生物信息学分析,从基因表达谱轮廓探讨不同转移潜能大肠癌细胞基因表达特点以及筛查大肠癌转移相关基因,为大肠癌的诊断、预后提供分子生物学指标,并初步从整体基因网络水平探讨大肠癌发生、转移机制。 生物功能分析采用GOTM(GeneOntologyTreeMachine)在线软件进行,GOTM它的特点是可以通过对上传的基因和表达信号值进行统计分析,指出显著相关富集基因群的GO分类域点,以提醒研究者进一步分析。 通过对筛查出的基因群生物功能分析,在两组共同表现上调或下调的基因群主要涉及细胞代谢、细胞生理进程调节、信号传导、大分子代谢、基本代谢和代谢调节等,有一部分基因生物过程功能未知(ABCC4、KLF6、HOXA9、HSPCA、IFI27、KRT10、TM4SF1、SDC4),由于这部分基因在两组中存在共性表达,是否与转移有关,还需进一步研究明确。 为进一步了解基因在细胞内的功能和代谢结构,我们把筛选出的SW620差异表达2555的基因 上传至PathwayExplorer,分析了解筛选基因在信号传导路径中的定位及作用。上传的基因中有996个与537个信号传导路径的6766基因中有效匹配达14.28%,没有完全匹配的路径,我们虽然应用是全基因组芯片,几乎包含了全部已知的人类基因和EST,但我们上传的是差异表达基因,因此,没有匹配的基因不能说没有表达,应该是这部分基因的表达值与SW480细胞接近。 另外,我们筛查出2个大肠癌转移相关的候选基因:MALAT1和FMNL2。MALAT1是一个新鉴定的非编码蛋白,染色体定位于11q13.1。MALAT1仅在SW620组高表达,可能与淋巴转移相关。由于MALAT1的相关研究文献较少,它具体的功能和表达的意义尚不明确,有研究发现MALAT1在早期非小细胞肺癌的高表达与转移显著相关,认为是早期非小细胞癌的预后预测因子。 综合分析结果,参与淋巴转移的大肠癌细胞似具有:细胞形态变形明显,易于松解;细胞的黏附、趋向运动、移动调节酶活性(蛋白激酶、转移酶)、金属离子结合功能下降,核酸代谢、转录活性增高,表型应有:CTNNB1、EGFR、EREG下调,BCL2L1上调。 四、CD73、CD24、Hsp27在大肠癌组织的表达及临床病理意义 选择在基因表达谱表达上调的CD73、CD24和Hsp27基因蛋白,应用免疫组化技术检测了20例临床未转移性大肠癌和19例伴有淋巴结和肝脏转移大肠癌3个部位癌组织的表达,以期评估同源性、不同转移潜能大肠癌细胞基因表达与在大肠癌组织表达的一致性,同时探讨其临床病理意义。 对19例大肠癌(含三个部位癌组织即原发灶、淋巴结和肝脏转移灶)的CD24、Hsp27和CD73免疫组化检测结果表明,每个表型在淋巴结转移灶和肝脏转移灶癌组织的表达均有显著差异(P<0.05~<0.001),与SW620和SW480/liver在基因芯片检测表达趋势一致,即CD24在SW620(淋巴结转移)中显著上调,Hsp27和CD73在SW480/liver(肝转移)表达上调,说明我们应用的同源性不同转移潜能的细胞模型基因表达与人体大肠癌组织表达相一致,达到了初步验证目的。 肿瘤的转移是一个复杂、连续和可调节的过程,其中涉及了多个宿主与肿瘤之间的相互作用,也涉及了许多的基因参与。随着这些基因在大肠癌转移过程中功能逐渐确定,将有助于开发新的治疗策略。 结论 1,大肠癌淋巴转移与瘤细胞形态明显变形,丝状伪足多,易于松解有关;存在细胞黏附、趋向运动、移动调节酶活性(蛋白激酶、转移酶)、金属离子结合等方面功能下降和核酸代谢、转录活性增高。 2,大肠癌肝转移与瘤细胞高增生状态、较强的同质黏附和侵袭能力相关,瘤细胞间黏附紧密可能是构建肝转移潜能的基础。 3,筛查出与大肠癌淋巴转移相关基因16个:ARF6、SERPINF、CST7、S-100P、PSMB8、SCEL、TFF2、TSPAN8、CLDNL、GALNT7、S-100A10、MAP2K6、TRAF5、2FP260、RPL37、VPP1。 4,筛选出大肠癌转移相关候选基因MALAT1和FMNL2。
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