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mCD99L2基因靶向siRNA诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的实验研究
中文名称: mCD99L2基因靶向siRNA诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的实验研究
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论文编号: 3122039收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Experiment Study of mCD99L2 Gene Targeted siRNA Transforms the Mouse A20 Cell Line into H/RS-like Cell
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 病理与病理生理学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 霍奇金淋巴瘤 小鼠A20细胞株 mCD99L2基因 CD99蛋白 RNAi siRNA慢病毒载体 动物模型
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论文简介:研究背景 淋巴瘤是原发于淋巴造血组织的免疫系统恶性肿瘤,随着AIDS、器官移植、肿瘤放化疗免疫抑制的应用等近年来发病率急剧升高。引人关注的是霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma,HL)独特的组织病理学特征,它虽是恶性淋巴瘤,但与非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin'slymphoma,NHL)却截然不同:⒈HE的恶性细胞成分H/RS细胞一般只占肿瘤组织的极少部分(<1%),其余是大量以淋巴细胞为主的背景细胞;⒉随着病变发展H/RS细胞的数量增加,而背景细胞数目减少;⒊H/RS细胞不但在原发灶内与背景细胞同时存在,而且在扩散转移的病灶内也同时出现;⒋患者的预后与H/RS细胞数量呈负相关,而与背景细胞数量呈正相关,极少量的H/RS细胞却直接影响着HL的恶性程度与预后。令人费解的是如此少量的H/RS细胞是如何生存于大量背景细胞之中?它与背景细胞之间究竟存在怎样复杂的相互关系?它虽然失去表达免疫球蛋白的能力,但却能逃避凋亡而持续增生;H/RS细胞是如何发生、发展而来的?要 人CD99(mic2)是一种32kD细胞表面跨膜糖蛋白,编码基因位于X和Y染色体短臂假染色体区(PAR)的Xp22.32-pter和Yp11-pter上,连锁分析提示PAR是HL的潜在致瘤基因,参与血细胞的分化等。Y.H.Suh(2003)首先报道了与人CD99同源的小鼠CD99基因——mCD99L2(MouseCD99antigen-like2)。 目的 1.明确cHL中H/RS细胞mic2/CD99表达与Eber-1/LMP-1表达的相互关系。 2.检测小鼠A20细胞株mCD99L2基因及构建siRNA慢病毒表达载体。 3.沉默A20细胞的mCD99L2基因,诱导其转化为H/RS样细胞,构建mCD99L2低表达的A20RSL(CD99L2-A20H/RS-likecell)细胞模型。 4.构建小鼠H/RS样细胞荷瘤裸鼠模型、荷瘤BALB/c小鼠模型。 方法 1.采用分子原位杂交和免疫组化技术并结合组织芯片技术检测59例石蜡包埋淋巴瘤组织标本[43例cHL,16例非霍奇金淋巴瘤(NHL)]mic2/CD99和Eber-1/LMP-1的表达,比较分析mic2/CD99在两组中的表达及与Eber-1/LMP-1的关系。 2.设计mCD99L2基因寡核苷酸探针和特异性PCR引物,采用分子原位杂交、RT-PCR方法和T-A克隆技术检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达。 3.运用RNAi技术构建入门载体PE-mCD99L2及siRNA慢病毒表达载体LV-mCD99L2,靶向沉默A20细胞mCD99L2基因,经过稳定转染和杀稻瘟菌素筛选克隆,用软琼脂克隆形成法和96孔板有限稀释法筛选A20-LV-mCD99L2单克隆。 4.应用PI染色、流式细胞术检测和分析siRNA慢病毒表达载体系统的转染率。 5.采用分子生物学技术检测A20-LV-mCD99L2克隆株基因组与LV-mCD99L2载体整合情况;RT-PCR、FQ-RT-PCR检测mCD99L2基因靶向RNAi的效率;在光镜、透射电镜、扫描电镜下观察A20-LV-mCD99L2单克隆的细胞形态特征;流式细胞术检测A20-LV-mCD99L2克隆株的细胞周期、细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖活性;光镜下测试网格计数法动态监测由A20-LV-mCD99L2克隆株转化为CD99L2-A20RSL细胞(直径~25μm)的转化率;Transwell检测A20-LV-mCD99L2克隆株的微侵袭能力;mCD99L2基因寡核苷酸探针原位杂交检测A20-LV-mCD99L2克隆株和CD99L2-A20RSL细胞的mCD99L2基因mRNA表达;免疫荧光标记CD15、CD30检测A20-LV-mCD99L2克隆株和CD99L2-A20RSL细胞的表达。 6.将A20-LV-mCD99L2克隆株移植到裸鼠皮下成瘤,并将体内成瘤的瘤组织块和原代细胞接种到下一代裸鼠,在裸鼠体内传3代,每一代瘤组织均作原代培养并做上述检测和鉴定,建立A20-LV-mCD99L2克隆株裸鼠皮下荷瘤模型。 7.分别将第一代和第二代裸鼠体内成瘤的实验组和对照组的瘤组织块和原代细胞株移植到BALB/c小鼠皮下成瘤,并将成瘤的瘤组织块和原代培养细胞做上述检测和鉴定。 结果 1.cHL中H/RS细胞mic2基因/CD99蛋白表达cHL组CD99蛋白表达阳性率为2.3%,mic2基因表达为55.8%,LMP1表达为58.1%,Eber-1表达为53.5%;NHL组CD99蛋白与mic2基因表达高于cHL组(P<0.05);LMP1和Eber-1的表达低于cHL组(P<0.05);mic2基因的表达高于CD99蛋白的表达(P<0.05);Eber-1与LMP1的表达无统计学意义(P>0.05)。CD99蛋白与LMP1的表达呈负相关(P<0.05)各项指标的表达与性别无关。CD99蛋白与LMP1的表达与年龄呈负相关(P<0.05),mic2与Eber-1的表达与年龄无关(P>0.05)。 2.A20细胞中mCD99L2基因检测及克隆 原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法获得mCD99L2基因cDNA序列,用T-A克隆技术获得mCD99L2基因克隆。DNA测序的结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)完全一致。 3.A20细胞mCD99L2基因靶向RNAi及CD99L2-A20RSL细胞模型的建立 4.皮下移植A20-LV-mCD99L2克隆株荷瘤裸鼠模型的建立 A20-LV-mCD99L2克隆株首代皮下移植裸鼠10只(30个位点),移植成功率63.3%,而第3代移植裸鼠8只(8个位点)移植成功率100%。A20-LV-mCD99L2克隆株在裸鼠体内传至第3代,共皮下移植裸鼠26只,平均潜伏期为7d,传代间期为20d。实验组A20-LV-mCD99L2细胞在裸鼠体内成瘤,光镜下见肿瘤细胞大小不一,弥漫分布,核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,病理核分裂像多见;可见散在胞质丰富的大细胞呈双核、多核,核仁大、微嗜酸性,呈典型的H/RS样细胞形态。检测肿瘤细胞中转染质粒与细胞基因组整合情况,电泳可见基因片段282bp,证实瘤体细胞携带质粒DNA,并整合到基因组。荷瘤组织原位杂交检测CD99L2-A20RSL细胞mCD99L2基因mRNA的表达,实验组细胞比对照组A20细胞明显减弱。荷瘤组织冰冻切片,CD30免疫荧光标记,结果与细胞模型一致。 5.皮下移植A20-LV-mCD99L2A1、A2细胞荷瘤BALB/c小鼠模型的建立 A20-LV-mCD99L2A1、A2瘤组织块和原代细胞分别皮下移植BALB/c小鼠6只(6个位点),平均潜伏期为6d。实验组成瘤率为33%。检测肿瘤细胞中转染质粒与细胞基因组整合情况,电泳可见基因片段282bp,证实瘤体细胞携带质粒DNA,并整合到基因组。光镜下见肿瘤细胞大小不一,弥漫分布,可见散在分布的胞质丰富的大细胞呈双核、多核,核仁大,呈典型的H/RS样细胞形态;在肿瘤细胞周围可见淋巴细胞、浆细胞、嗜酸细胞和组织细胞等背景细胞,出现了类似人cHL的组织病理表现。 结论 1.cHL中H/RS细胞CD99蛋白表达与LMP1的表达呈负相关关系,CD99蛋白在H/RS细胞中低表达,可能是H/RS细胞表型变化特点之一,具有临床病理诊断和鉴别诊断意义。 2.小鼠A20细胞具有mCD99L2基因的mRNA表达,沉默目的基因mCD99L2的siRNA靶序列(nt205-nt223),能诱导A20细胞转化为H/RS样细胞,即CD99L2-A20RSL细胞。mCD99L2可能是A20细胞转化为H/RS样细胞的关键基因。 3.将A20-LV-mCD99L2克隆株皮下移植裸鼠和BALB/c小鼠,可获得荷瘤裸鼠模型和荷瘤BALB/c小鼠模型,后者出现了背景细胞,类似人cHL的病理形态特征。 创新之处 1.应用组织芯片技术、原位杂交和免疫组化技术同步检测cHL石蜡标本中mic2/CD99、Eber-1/LMP-1的表达,证实cHL中H/RS细胞CD99蛋白表达与LMP1的表达呈负相关关系,明确了cHL中H/RS细胞mic2基因mRNA与CD99蛋白表达的不一致性,提出CD99蛋白在H/RS细胞中低表达,可能是H/RS细胞表型变化的特点。 2.运用原位分子杂交和RT-PCR的方法证实了A20细胞具有mCD99L2基因。 3.运用RNAi技术靶向沉默A20细胞mCD99L2基因,诱导A20细胞转化为H/RS样细胞,初步建立了小鼠H/RS样细胞模型,命名为CD99L2-A20RSL细胞。 4.将A20-LV-mCD99L2克隆株皮下移植到裸鼠成瘤,并在裸鼠体内传代,建立了CD99L2-A20RSL细胞荷瘤裸鼠模型。 5.将两代裸鼠体内成瘤A20-LV-mCD99L2A1和A2分别皮下移植到BALB/c小鼠体内,初步获得荷瘤BALB/c小鼠模型,并出现了典型的类似人cHL的组织病理表现。
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