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RNAi技术在抑制HBV复制和表达中的应用
中文名称: RNAi技术在抑制HBV复制和表达中的应用
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论文编号: 3122027收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Appling of RNAi Technique on Inhibition HBV Replication and Expression
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: RNA干扰(RNAi) 乙型肝炎病毒(HBV) 复制 RNA干扰 乙型肝炎病毒 RNAi技术
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论文简介:乙型肝肝炎病毒(HBV)是一种长3.2Kb的DNA病毒,它几乎在整个肝脏可以复制。虽然高活性的乙肝疫苗已问世20多年,但HBV感染仍然是一种危害全球健康的重大疾病。据统计全球约有3.5亿的HBV感染者,而中国又是HBV感染的高发区,约有50%~70%的人群感染过HBV,其中约8%~12%的人群,即超过1亿人口是乙肝表面抗原携带者,每年因急慢性HBV感染致死的人数约有一百万之多。目前,干扰素和腺苷类似物是FDA批准的,仅有的几种抑制HBV复制的药物,但它们的作用效果都很有限。腺苷类似物如lamivudine和adefovirdipivoxil的作用原理是通过抑制HBV逆转录活性,而直接影响病毒复制的,虽然这类药物能高效地清除血清中的HBV-DNA,但不能完全清除体内感染的HBV,因此停止用药后HBV会复发,并且用药时间的延长会导致HBV病毒突变体的产生。 RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的,细胞内mRNA发生特异性降解,并导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的一种现象。这一现象属于转录后的基因沉默机制(Posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。在哺乳动物细胞中RNAi活性主要是通过21~23nt长的smallinterferingRNAs(siRNA)来实现的。研究表明siRNA已在很多领域显示出对目的基因的清除作用,因此,RNAi也成为治疗HBV感染的一种可选的重要手段。 自1998年2月,Fire和Mello两位科学家首次在Nature上发表了:把dsRNA注射入一种线虫(Caenorhabditiselegans)体内,该dsRNA可以诱导基因靶向专一性的基因表达静寂(genesilencing)等研究报告以来,许多研究工作者都先后用RNAi技术,在线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳类细胞中进行了大量研究,他们采用不同长度的dsRNA,可使不同类型细胞的靶向基因表达明显降低,有时甚至用专一性抗体都检测不到靶向基因所表达的蛋白质或肽类。因此,人们形象地称用RNAi技术可使基因敲低(knockdown)或使基因静寂。这是一种典型的转录后基因调控方法,又称转录后基因静寂(PTGS)。关于sRNAi的研究报告越来越多,结果也越来越令人振奋。德国科学家Elbashir等人在Nature上发表了:将长度为21个核苷酸(21nts)的双链RNA(siRNA)用于培养的哺乳动物细胞,siRNA可使哺乳动物细胞的靶基因表达明显降低。随后他们又在2001年12月CellScience详细介绍了siRNA技术,并利用该技术分别使16个靶基因表达降低或静寂,从而引起了更广泛的关注。一些科学家预测,由于这种RNAi技术比基因敲除技术更方便快捷地显示出基因的功能,因此,有希望用于治疗某些由于特定基因表达过度引起的疾病,或者由病毒或寄生病原性蛋白表达引起的疾病。尤其有希望用于治疗癌基因或突变基因引起的癌症。 本研究分别通过体外合成和体内载体表达两种途径获得双链siRNA,然后研究其对哺乳动物细胞内HBV复制和表达的抑制作用。首先针对HBV基因组序列设计分别靶向于S基因区、C基因区和P基因区的siRNA序列,用BLAST软件分析所设计的siRNA与人类基因的同源性,结果显示设计的siRNA和人类基因没有完全同源之处(不会引起人类相关基因静默)。然后依照此序列由Invitrogen公司合成siRNA,并化学修饰得到StealthsiRNA,他们分别是stealth_508靶向HBV基因组的S区和P区(nt508-532),stealth2311靶向HBV基因组的C区(nt2311-2335),stealth2765靶向HBV基因组的P区(nt2765-2789)。修饰后的StealthsiRNA较标准siRNA具有更好的稳定性、不易降解,而且通过修饰消除了其正义链的RNAi作用,仅反义链具有RNAi的作用,这就大大降低了非特异性基因静默的可能性。 2.2.15细胞是稳定转染了HBV基因组的肝母细胞瘤细胞系,实验选用此细胞系作为研究对象,分别用脂质体介导三种StealthsiRNA转染HepG22.2.15细胞,培养相应时间后,用ELISA法检测HBV表面抗原及e抗原的表达,用荧光定量PCR检测HBV的DNA拷贝数。 为构建双链siRNA的真核细胞表达载体,以人基因组DNA为模板扩增人U6启动子,并在两端引入EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点,通过此酶切位点将U6启动子重组到pUC18载体中,构建真核细胞shRNA表达载体pU6。在真核细胞中U6启动子可以使其后DNA序列转录成RNA。依照StealthsiRNA的序列,采用两套方案将与之对应的shRNA的DNA序列插入载体pU6。一种方案是直接合成双链DNA,两端分别为SmaⅠ和HindⅢ酶切末端,载体pU6经对应酶酶切后,与合成的双链DNA进行连接就可获得针对HBV的shRNA表达质粒pU6/HBVi。另一种方案是利用PCR延伸技术,上游用一条与U6启动子结合的引物,下游分别用两条引物(第一条能与U6启动子结合)分两次将针对HBV的shRNA的DNA序列延伸到U6启动子的下游,同时在两端分别引入EcoRⅠ(上游引物)和HindⅢ(下游第二条引物)的酶切位点,最后将第二次扩增产物和载体经相应内切酶酶切、连接、就获得针对HBV的shRNA表达质粒pU6/HBVi。 实验中,我们采用两种不同的方法构建了针对HBV的shRNA表达质粒pU6/HBVi。第一种方法是传统的构建模式,优点是快速准确,但插入的shRNA序列受酶切位点的限制,因必须保证U6启动子与插入的shRNA序列之间没有无关碱基。第二种方法的优点是可插入任意序列的shRNA,但因为引入shRNA序列的引物有发卡结构,PCR条件不易优化。 此外,我们还利用pUC19将shRNA的表达框(shRNAExpressionCassette,SEC)在载体中的方向进行了调换,构建了针对HBV的shRNA表达质粒pU6B/HBVi。最后将构建好的针对HBV的shRNA表达质粒pU6/HBVi和pU6B/HBVi,以脂质体介导转染2.2.15细胞,培养相应时间后,用ELISA法检测HBV表面抗原及e抗原的表达,用荧光定量PCR检测HBV的DNA拷贝数。 ELISA检测结果显示,用StealthsiRNA及构建的质粒pU6B/HBVi转染2.2.15细胞后,实验组与对照组比较,实验组细胞中的HBV表面抗原及e抗原的表达均被显著性抑制;荧光定量PCR检测检测结果显示,实验组细胞中HBV的复制也被显著性抑制,甚至HBVDNA可被完全清除。 综上所述,我们设计的StealthsiRNA及构建的针对HBV的shRNA表达质粒pU6B/HBVi,对HBV的复制和表达均有显著性的抑制作用,这为临床HBV的生物治疗奠定了实验基础,也为HBV的治疗提供了一种新途径;同时,我们构建的真核细胞shRNA表达载体pU6为RNA干扰技术提供了一种新的可选择的技术平台。 目前,尽管RNAi技术仍有一些问题尚未解决:如给药途径及安全性等问题,但RNAi这一新技术还是为相关疾病的治疗研究及新药研发,开拓了一个全新方向。一旦RNAi技术发展到能用于临床治疗艾滋病、肝炎和恶性肿瘤等疾病时,这将会掀起一场,对病毒性、寄生病原性、突变基因和癌基因表达等导致的疾病基因治疗方面的新革命。
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