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人巨细胞病毒感染ECV304细胞的病变效应及基因组表达谱研究
中文名称: 人巨细胞病毒感染ECV304细胞的病变效应及基因组表达谱研究
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论文编号: 3122026收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Studies on Cytopathic Effects and Genome Gene Expression Profiling of ECV304 Cells Infected with Human Cytomegalovirus
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 生物化学与分子生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 人巨细胞病毒 表达谱芯片 细胞病变效应 生物信息学 疱疹病毒 人巨细胞病毒感染 病变
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论文简介:人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)是人类最常见的先天性感染病毒,HCMV的人群感染率高达80%以上,是目前引起孕妇活动性感染及胎儿宫内感染最常见的病因之一,造成出生缺陷,与弓形虫(Toxoplasmosis)、风疹病毒(Rubellavirus)、单纯疮疹病毒(Herpessimplexvirus)、梅毒螺旋体(Syphilis)一起,并称为人类五大生物致畸因子。同时,HCMV也是机体免疫功能低下的人群,如艾滋病患者、放射损伤个体、器官移植和恶性肿瘤等病人并发感染死亡的常见原因之一。肾、肝、心脏、肺等器官移植后HCMV感染率分别达8%、29%、25%及39%。此外,HCMV还与心血管疾病、肿瘤的发生密切相关。因而,开展HCMV感染的病变特征与分子致病机制的研究,对于HCMV感染的防治和人口素质的提高都具有重要的意义。 HCMV即人类疱疹病毒5型(humanherpesvirus5,HHV-5),属于疱疹病毒β亚科。病毒颗粒为正二十面体,核酸外壳由一个蛋白质包膜及脂质双分子层组成,中间为病毒基质,成熟的病毒颗粒大小约200nm,其核衣壳直径大小约为100nm。内部核酸为线性双链DNA分子。HCMV基因组DNA大小为230kb,是动物DNA病毒基因组最大的一类,编码了200多种不同的病毒蛋白,由长独特序列(UniqueLong,UL)和短独特序列(UniqueShort,US)及两端的反向重复序列TRL、IRL、IRS及TRS组成,通过UL和US连接部位重复序列的倒置,可形成四种同分异构体。 表达谱芯片能同时检测成千个基因的表达,对来源于不同的个体、组织、发育阶段、分化阶段、病变及刺激下的细胞内mRNA总体表达水平进行检测,从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,可进一步研究基因与基因间相互作用的关系,提供细胞的表达调控信息。 表达谱芯片在研究包括病毒在内的病原与宿主细胞相互作用方面应用十分广泛。宿主细胞病原感染表达谱变化特征反应了病毒感染的结果,约有30种病毒和26种细菌感染25种不同类型的宿主细胞表达谱已被分析研究。以参与刺激的病原及宿主细胞的类型及作用方式归纳为8种模式:1.用野生型的病原体外直接感染宿主细胞,在多个感染阶段监测表达;2.多种病原体感染同一种宿主细胞,以寻找共同参与宿主细胞防御的基因;3.用突变株或灭活病原刺激宿主细胞;4.研究病原体的特殊蛋白成分致病性;5.同种病原感染正常及突变细胞系的对比研究;6.小分子物质参与病原-宿主反应通路作用的研究;7.细胞体外感染病原后转入体内后基因的差异表达研究;8.临床样本与动物模型差异表达的研究。 已有研究将DNA表达谱芯片应用于HCMV的相关研究,包括HCMV和宿主细胞的两方面的感染表达谱研究。由于所基于的技术平台不同,在芯片的类型,芯片的密度,探针的性质,样本的标记方法等方面都有所不同,在结果上有所差异。这些研究采用自制的或传统的DNA表达谱芯片,研究仅局限于HCMV基因组表达谱或宿主细胞表达谱的某些方面。研究的细胞主要为人成纤维母细胞(HFF)。ECV304细胞是1990年首次报道,由一日本人的脐静脉内皮细胞自发转化为的一株永生化细胞株,曾作为血管内皮的模型在生物学及医学研究中广泛应用。本研究报道了血管内皮样ECV304细胞体外感染HCMV的病变效应,并利用寡核苷酸表达谱芯片分析感染引起的宿主细胞基因组表达谱变化及其意义,旨在探索HCMV的致病相关分子机制。 本研究包括以下三个部分: 一、HCMV感染ECV304血管内皮样细胞的病变效应研究 用HCMVAD169感染ECV304血管内皮样细胞,观察病毒的感染对细胞生物性状的影响。以常规方法传代培养细胞和接种病毒,用PCR法和间接免疫荧光法分别检测病毒即刻早期基因(IEgene)及HCMV特异的基质蛋白(pp65),相差显微镜及电子显微镜观察病毒感染后细胞形态及细胞内部变化,DNAladder法、TUNEL检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期及凋亡峰。 结果发现,ECV304细胞病毒感染后2d开始出现变化,到感染4d变化明显,出现感染细胞的胞体变圆、缩小、脱壁,胞浆内颗粒增多,细胞边缘模糊的特征,通过对病毒特异IEgenePCR扩增及HCMV的基质蛋白(pp65)表达的检测,明确了HCMV对ECV304血管内皮样细胞的感染;电镜观察结果表明,病毒感染4d后,胞浆内明显空泡化,细胞膜微绒毛减少,核染色质的浓集、边缘化,线粒体出现溶酶体化、空泡化和自噬现象,形态学呈早期凋亡特征;DNALadder电泳结果显示感染细胞DNA片段化的特征条带;流式细胞仪检测感染4d和6d细胞凋亡率分别为4.1%和45.7%。细胞周期分析表明,到感染4d时S期细胞的增加,感染第6d,可见S期细胞明显减少。结果提示,HCMV感染影响并调控了细胞内DNA合成,表现为细胞周期变化。本研究表明,巨细胞病毒在体外细胞培养中可诱导ECV304血管内皮样细胞的凋亡。 二、基因组表达谱芯片筛选HCMV感染ECV304血管内皮样细胞的差异表达基因 本部分研究中,用包含18716个基因60mer寡核苷酸探针的表达谱芯片筛选HCMV感染ECV304血管内皮样细胞的差异表达基因,旨在分子水平上探讨HCMV的致病机制。收集HCMV感染4d的ECV304及对照细胞,用Trizol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测RNA样本浓度和纯度,并用cRNA线性扩增标记试剂盒进行双色荧光标记,标记样本与Agilent公司G4110BHuman1A(V2)Oligo芯片杂交,利用Agilent2565BA基因芯片扫描仪进行图像扫描,以AgilentG2567AAFeatureExtraction软件筛选差异表达基因。芯片杂交结果表明,背景均一,信号点与背景荧光信号对比显著,芯片杂交效果好。筛选得到的差异表达基因559个,471个基因表达上调,已明确功能的334个,有88个基因表达下调,已明确功能的有69个,这些差异表达基因功能可能涉及了HCMV感染调控的生物过程及致病机制。 三、表达谱芯片结果的验证与生物信息学分析 对基因表达谱芯片结果进行荧光定量PCR法验证,以明确芯片实验的准确可靠性,也是进一步数据挖掘和分析的前提。DNA表达谱芯片数据的生物信息学分析有助于更完整地了解基因的功能、调控和相互作用。选取RPS24、MGC8721、SLC27A3、MST4、TRAF25个上调基因和LRRC281个下调基因,采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光法荧光定量PCR分析,对基因芯片表达谱结果进行验证。用Onto-Express(OE)进行GeneOntology(GO)定义的细胞分子生物过程分析,AnnotationDatabase软件对病毒感染的生物过程涉及基因进行功能注解与分析。实验结果显示,芯片的结果与荧光定量的测定结果的结论一致。分析结果表明,HCMV感染ECV304细胞涉及273个生物过程,其中39个生物过程具有显著性意义,包括:细胞信号转导、依赖DNA的转录调节、血管形成、血管内皮生长因子调节、生殖发育、雌激素代谢、DNA复制依赖的核糖体装配、衰老、上皮细胞分化、物质代谢、细胞周期调节等生物过程。这些生物过程都是涉及了细胞内重要的生命活动,其中细胞信号转导过程的统计学意义最为显著(p=0.005),表明HCMV对宿主细胞具有较强的转录调控能力,导致了细胞内的信号转导的明显变化。生物信息学的分析结果提示,许多显著性分子生物过程及其组成基因可能与HCMV感染ECV304细胞的分子机制有关。HCMV感染引起的差异表达基因还涉及多个与HCMV感染及致病机制相关的生物学过程,这些生物过程及基因包括:细胞凋亡相关基因:GranzymeB、DAPK2、TARF2、TNFSF9、TNFSF10、Bcl-2L10、TGFBRAP1;G蛋白偶联受体信号传导通路基因:RGS6、RGS2、GIT1;c-Jun氨基末端激酶及MAPK通路组成基因:CRKL、SH2D3A.、MAP2K2;细胞周期相关基因:cyclinE、E2F;肿瘤相关基因:MYCL-2。 本研究主要结论如下:HCMVAD169可致ECV304血管内皮样细胞病变,细胞周期发生变化,表现明显凋亡特征。筛选到559个基因差异表达,471个为表达上调,88个为表达下调,差异表达的基因;实时荧光定量PCR验证结果结果表明芯片结果可靠。生物信息学方法分析显示,HCMV感染引起的细胞变化涉及273个生物过程,涉及与凋亡过程、细胞周期调节、HCMV致病等多个过程,其中39个具有显著性意义,细胞信号转导过程的统计学意义最显著。
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