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猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的研究
中文名称: 猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗的研究
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论文编号: 3121920收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study on Multicomponent Recombinant Subunit Vaccines Against Actinobacillus Pleuropneumoniae
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 基础兽医学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 胸膜肺炎放线杆菌 毒力因子 克隆 重组亚单位疫苗 保护效力 传染性胸膜肺炎
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论文简介:猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。由于APP极易产生耐药性,疫苗接种是防控本病的主要措施。目前,国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病。但由于APP血清型较多,灭活疫苗的保护效果十分有限。因此,开发新型疫苗已经成为研究热点。研究表明,通过分子生物学手段构建的一些PCP弱毒疫苗和新兴起的一种ghosts疫苗较灭活疫苗的免疫保护效果有明显提高,但这两种疫苗也存在一些问题,弱毒疫苗随着毒力降低,其免疫原性也有所降低,且存在毒力返强的可能性,而ghosts疫苗则存在菌体裂解不彻底等缺点。 以天然提取的APP毒力因子为组份的亚单位疫苗则不存在上述缺点,且这种疫苗能诱导产生很好的免疫保护,但就其制备方法而言,存在着提取成本高、产量低和不适于大量生产等缺点。鉴于此,本试验通过基因工程方法,重组表达APP的多种毒力因子,制备多组份重组亚单位疫苗,并进行了免疫保护效果的探讨。 研究表明,APP分泌的外毒素(ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ)和外膜蛋白(OMP)等不仅是APP重要的毒力因子,同时也是重要的免疫原性因子,它们已经作为4种重要的候选抗原应用于APP亚单位疫苗的研究,但APP菌毛(ApfA)和最近发现的的外毒素IV(ApxV)作为APP的另外两个重要毒力因子,尚未见其应用于亚单位疫苗的研究报道。根据ApfA在定居宿主细胞过程中发挥的重要作用及ApxIV能刺激机体产生较高的抗体水平这一点,推测二者可能会在交叉保护方面起促进作用。因此,本试验首次将Apfa和ApxIV也作为疫苗组份进行了研究,并首次制备以4种和6种重组蛋白为组份的重组亚单位疫苗,通过对BALB/c小鼠的免疫攻毒保护试验,与灭活疫苗进行了保护效力的比较。具体试验内容与结果如下: 1采用PCR方法分别从APP2型S1536株、APP1型72-1株和APP7型25-4株中扩增到APP的重要保护性抗原基因apxⅢ4(3114bp),apxIVA(2553bp)和omp(963bp)。序列测定后与GenBank发表的其他菌株进行同源性比较。结果表明,所扩增的apxⅢA基因与血清2型和血清8型405株的核苷酸同源性分别为98.4%和97.8%,氨基酸同源性分别为98.9%和97.1%;apxIVA基因与血清1型4074株和3型HV114株的核苷酸同源性分别为99.9%和99.2%;氨基酸同源性分别为99.9%和98.9%;omp基因与血清3型S1421株、血清6型Femo株和血清7型WF83株的核苷酸同源性分别为98.3%、98.2%和100%,氨基酸同源性分别为98.8%、98.8%和100%。以上结果说明所扩增的日的基因在不同血清型之间非常保守,尤其是apxIVA和omp基因。 2成功构建了重组表达载体pGEX-apxⅢA,pGEX-apxⅣA和pGEX-omp。并将6种重组表达载体pGEX-apxⅢA,pGEX-apxIVA、pGEX-omp、pGEX-apxIA、pGEX-apxⅡA和pGEX-apfa(后三种为实验室已经构建好)分别在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,获得6种重组蛋白GST-ApxI(rApxI)、GST-ApxⅡ(rApxⅡ)、GST-ApxⅢ(rApxⅢ)、GST-ApxⅣ(rApxIV)、GST-Apfa(rApfa)和GST-OMP(rOMP),大小分别约116、110、140、118、42和62Ku。Western-blot分析表明,6种重组蛋白具有良好的抗原性。 3将rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合作为疫苗Ⅰ组,rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxIV、rApfa和rOMP组合作为疫苗Ⅱ组,APP1型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBS作为空白对照组,进行小鼠的免疫攻毒保护试验。免疫共分3次,每次间隔两周。第3次免疫后第7d,分别以APP1型菌(5×109cfu)和APP2型菌(5×1010cfu)进行攻毒。通过检测血清特异性抗体、脾淋巴细胞增殖及L-2水平的动态变化,结合攻毒后小鼠的存活率、肺脏病理变化及间接免疫荧光的抗原定位,综合评价重组亚单位疫苗的免疫保护效果。结果表明,疫苗Ⅰ组的抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及IL-2水平均显著高于其他3组(P<0.05),且疫苗Ⅰ组对APP1型菌攻毒的保护率(9/10)明显高于疫苗Ⅰ组(5/10)、疫苗Ⅲ组(6/10)和空白对照组(0/10),对APP1型和APP2型菌攻击后的肺脏保护作州明显优于其它3组。同时,间接免疫荧光检测表明,疫苗组对肺脏细菌的消除效果也明显优于其他3组。揭示了疫苗Ⅰ组可通过激活体液免疫和细胞免疫反应,对不同血清型APP的攻击提供了很好的交叉保护作用。本研究为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。
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