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反义肝素酶基因对胰腺癌抑制作用实验研究
中文名称: 反义肝素酶基因对胰腺癌抑制作用实验研究
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论文编号: 3121648收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Experimental Studies on the Inhibition of Pancreatic Cancer by Antisense Heparanase Gene
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 胰腺癌 乙酰肝素酶 反义 载体 转染 移植瘤 基因治疗
简介目录: 点击此处 免费索取本论文简介和目录>>
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论文简介:[目的] 胰腺癌生物学侵袭性高,易发生早期转移,术后5年生存率不到5%,是预后最差的消化道恶性肿瘤之一。肿瘤局部浸润和转移是影响手术效果和生存期的主要原因。尽管目前胰腺癌的治疗方式有了很大发展,但总的治疗效果不佳,在分子水平寻找与胰腺癌侵润、转移相关的基因并探讨其作用机制是提高胰腺癌疗效的关键。近年来,有关胰腺癌的发病机制,尤其是转移机制方面的研究成为热点。肝素酶基因是近年来发现并成功克隆的与肿瘤相关的基因,在肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用。乙酰肝素酶是一种葡萄糖醛酸内切酶,能特异识别并切断细胞外基质主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸肝素侧链,进而破坏由细胞外基质和基底膜组成的屏障结构,在肿瘤细胞浸润、转移和肿瘤血管形成过程中起着重要作用。目前的研究表明,肝素酶与多种恶性肿瘤的转移和侵袭相关,同患者的预后相关,因此肝素酶可能是大多数肿瘤都具有的肿瘤特异性共有抗原,并可能成为一个有良好应用前景的基因治疗靶点。肿瘤基因治疗的发展为胰腺癌的治疗提供了一个有前途的新手段,针对胰腺癌侵润、转移相关的基因的反义基因治疗具有重要地位。目前未见以肝素酶为基因靶点的反义核酸治疗胰腺癌的基础研究。本课题利用免疫组化、基因重组、基因转染、细胞培养、动物模型等分子生物学技术,在肝素酶与胰腺癌转移及肿瘤血管生成密切相关的临床研究前提下,构建正、反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并转染人胰腺癌SW1990细胞株,进一步通过体外和体内实验研究反义肝素酶基因对胰腺癌浸润转移及血管生成能力的抑制作用,试图找到一种抑制胰腺癌生长和转移的新途径,为反义肝素酶基因在临床治疗胰腺癌提供依据。 [方法] 收集78例临床确诊的胰腺癌标本,以免疫组化SP法检测胰腺癌中肝素酶及CD34的表达,分析肝素酶表达与胰腺癌临床病理特征及与肿瘤微血管密度(MVD)的相关性。采用基因重组技术,将人肝素酶cDNA连入pIRES2-EGFP质粒,经限制性内切酶酶切和T4连接酶连接构建成正、反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体;用脂质体法将 肝素酶反义表达载体pIRES2-EGFP-aHpa(反义组)、pIRES2-EGFP空载体(空载组)转染人胰腺癌SWl990细胞株,并设未转染质粒的空白对照组。转染细胞经G418筛选出高表达株并稳定传代,荧光倒置显微镜下观察转染结果。以免疫组化SP、Western B10t免疫印迹及RT-PCR法检测转染细胞肝素酶蛋白和mRNA表达,比较反义组、空载组和空白组细胞肝素酶表达差异。以MTT法绘制转染细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,平板克隆形成实验检测细胞增殖活性,TranSWe11侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力,比较三组细胞生长增殖和侵袭能力的差异;将转染细胞注射于裸鼠皮下建立胰腺癌移植瘤模型,观察移植瘤生长曲线、抑瘤率,以免疫组化方法检测移植瘤肝素酶表达和肿瘤微血管密度,比较三组的差异。 [结果] 1、肝素酶蛋白主要表达于胰腺癌细胞胞浆及胞膜中,经免疫组化检测,78例胰腺癌中肝素酶表达阳性率为75.6[%],显著高于在正常胰腺组织中的表达(P<0.01)。肝素酶表达与胰腺癌浸润转移相关,有淋巴结或远处转移者表达明显升高(P<0.05);同TNM分期相关,Ⅲ~Ⅳ期阳性率较Ⅱ期升高(P<0.01),而与患者性别、肿瘤部位、大小、分化程度无显著相关性(P>0.05)。胰腺癌中肝素酶表达阳性者MVD值明显高于肝素酶表达阴性者(37.2±10.2VS18.9±4.8),二者有显著差别(P<0.01)。上述结果显示肝素酶同胰腺癌的浸润、转移及肿瘤血管生成相关,提示肝素酶的表达促进了胰腺癌组织的侵润、转移及血管生成。 2、用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7kb的肝素酶全长cDNA片段,连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRI酶切位点上,经BamH I酶切后,正义重组质粒形成5.3kb和1.7kb两条DNA片段,反义质粒为6.5kb和0.5kb两条片段,与理论计算值一致,成功构建正义和反义绿色荧光真核表达载体(pIRES2-EGFP—sHpa和pIRES2-EGFP—aHPa),测序结果进一步确认了方向的正确性。将重组质粒转染胰腺癌Swl990细胞,该细胞在倒置荧光显微镜下呈现明亮绿色荧光,提示转染成功。 3、将稳定转染的SWl990细胞制成细胞爬片以免疫组化检测肝素酶表达,反义组较对照组表达强度减弱。以RT—PCR和western blot检测转染细胞的肝素酶mRNA和蛋白表达,反义组与对照组比较,mRNA及蛋白表达灰度分析值(IDV)明显降低(28.5±5.4VS42.5±7.2、43.4±6.7和126.5±12.1 Vs 198.2±l5.4、203.5±21.3),分别较对照组降低34.3[%]和37.8[%],差异有显著性(P<0.05)。进一步观察反义肝素酶基因对胰腺癌细胞生长和侵袭的影响,与对照组比较,反义组细胞周期中 S 期比例明显减少(18.8±2.5%vs3.2±2.1%、36.3±2.2%),G<,1>期细胞比例明显升高(66.0±2.7%vs9.8±4.9%、30.7±3.2%);细胞生长速度明显减慢,克隆形成数目减少(12.2±2.8vs8.3±2.7、30.8±4.4),克隆形成率降低(24.4%vs56.6%、61.6%);Trariswell侵袭小室中24h穿膜细胞数减少(13.0±3.5vs29.4±5.6、34.8±5.8),比较均有显著差异(P<0.01)。上述结果提示,反义肝素酶基因转染抑制了胰腺癌SWl990细胞的体外生长、增殖和侵袭活性。 4、建立裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型后,三组细胞均成瘤。与对照组比较,反义组成瘤时间晚,生长缓慢,瘤体较小(P<0.01),抑瘤率在第6周时达64.2%;移植瘤肝素酶表达免疫组化染色评分(IHS)明显降低(3.8±1.2VS9.5±2.3、10.2±2.0),MVD计数明显降低(18.6±2.2VS33.3±5.3、34.9±3.2),均有显著差异(P<0.01)。上述结果提示反义肝素酶基因抑制了裸鼠人胰腺癌移植瘤生长和血管生成。 [结论] 1、肝素酶在胰腺癌中高表达,同胰腺癌转移、分期及血管生成密切相关,肝素酶有可能成为抗胰腺癌转移及血管生成治疗的新靶点。 2、反义肝素酶基因抑制胰腺癌细胞SWl990肝素酶mRNA及蛋白表达,其作用环节可能在基因转录水平。 3、反义肝素酶基因抑制胰腺癌细胞SWl990的体外生长和侵袭活性,抑制了SWl990细胞的恶性特性。 4、反义肝素酶基因抑制裸鼠移植瘤生长及血管生成。 上述结果为反义肝素酶基因在临床治疗胰腺癌提供了实验依据。
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