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RECK基因在脑胶质瘤细胞中的研究
中文名称: RECK基因在脑胶质瘤细胞中的研究
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论文编号: 3121590收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Study of RECK Gene in the Glioma Cells
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 外科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: RECK 胶质瘤 免疫组化 PCR 转染 基因表达水平 脑肿瘤
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论文简介:肿瘤是一类常见的严重危害人类健康的体细胞遗传病,其发生率和死亡率均呈逐年上升的趋势,恶性肿瘤已经成为人类致死的第一或第二位病因。通过对肿瘤的家系分析、流行病学以及大量的动物实验研究证明了肿瘤是环境因素与遗传因素相互作用导致的一类多基因参与的疾病。目前研究的结果以表明肿瘤是细胞中多种基因突变累积的结果。目前大量的努力致力于了解人类肿瘤的侵袭和转移的分子机制。一些分子包括粘附分子、金属蛋白酶和血管粘性分子被认为在侵袭和转移中起到关键作用。RECK基因于1998年被日本京都大学分子肿瘤研究室通过cDNA表达克隆的方法从v-ki-ras转化的NIH3T3细胞系中表达诱导扁平形态的基因中分离出来。 胶质瘤是一种最常见的颅内肿瘤,统计资料表明其发生率占全部颅内肿瘤的40%。虽然手术切除肿瘤,放疗,化疗治疗胶质瘤均取得了较好的效果,然而恶性胶质瘤术后中位生存期仅为14周,其术后一年生存率也不足50%,而2年生存率则低于10%。目前,判断胶质瘤预后尚无有效的诊断方法。我们通过用RT-PCR的方法检测胶质瘤及中枢神经系统良性肿瘤组织中RECK、MMP-9和MMP-2的表达情况,以及免疫组化的方法检测了胶质瘤及中枢神经系统良性肿瘤组织中RECK蛋白的表达情况,探讨RECK这一肿瘤抑制基因在此类肿瘤进展中所起的作用,以及与患者预后的关系,为研究颅内恶性肿瘤的基因诊断和基因治疗提供依据。 实验材料和方法 1.标本来源:标本来自中国医科大学第一医院神经外科2002年9月至2003年9月间,外科手术切除新鲜胶质瘤、颅内良性肿瘤和正常脑组织标本共73例。其中胶质瘤58例、脑膜瘤6例、听神经鞘瘤4例、垂体瘤2例、正常脑组织3例。患者包括43例男性和30例女性。年龄跨度在30~69( ±SD,53.06±8.65)岁之间。所得标本经本院病理科组织学检验证实并冻存于-70℃备用。 2.免疫组化:为确定RECK基因表达的细胞相关性,上述标本进行了免疫组化分析。石蜡包埋,4μm切片,烤片5分钟,0.3%H<,2>O<,2>溶于甲醇灭活内源性酶,蛋白封闭,血清30’孵育。用鼠抗hRECK单克隆抗体做一抗4℃孵育过夜。PBS洗,用生物素标记的二抗孵育45’,然后用Veetastain.ABC试剂盒抗生物素一生物素过氧化物酶方法染色。颜色反应在含0.1%H<,2>O<,2>的0.03%3’-2氨基联苯胺四氯化物溶液中进行。苏木素复染,封片。试剂盒中的阳性片用于阳性对照,PBS代替一抗用于阴性对照。 3.RNA提取和RT-PCR:取-70℃冻存肿瘤组织块约1克,用异硫氰酸胍/酚/氯仿抽提法提取总RNA,经紫外分光光度法定量后,取5微克RNA用于RT-PCR。RT-PCR用Takara两步法试剂盒。引物序列见表1。PCR扩增条件:94℃40秒,61℃~58℃每一循环降低0.5℃35秒,72℃45秒,共30个循环,500bpβ-actin用于内对照。1%琼脂糖电泳,PCR产物与设计产物长度相符,经测序验证。电泳图像用电泳图像采集系统扫描到计算机作进一步分析。 4.基因表达半定量分析:利用Smart View电泳图像分析软件对各个基因的表达做半定量分析,如图1所示每个样品在电泳后均有2条带,假设β-aetin在各个样品中的表达水平相同,并设定为1,然后以这个表达水平为参照,检测相应的基因表达水平,结果为相对定量值,以数字表示,用于统计分析。 5.相关关系的统计学分析:生存时间的计算从手术日期至死亡日期,或随访日期。患者的临床和组织病理学特征与RECK蛋白表达相关关系比较用x2检验;各类肿瘤的RECK、MMP-9、MMP-2mRNA基因表达水平相关关系比较用SNK统计分析。统计分析用SPSS11.5。P<0.05视为有统计学意义。 1.PCR扩增得到的RECK、MMP-2、MMP-9基因的产物长度分别为227bp、212bp、152bp。 2.RECK在脑胶质瘤及良性脑肿瘤中的表达:在58例脑胶质瘤患者中有19例RECK表达相对定量值>0.50,按照’WHO分级I~Ⅱ级17例,Ⅲ-Ⅳ级2例。其余39例RECK表达相对定量值均<0.50,其中32例为Ⅲ-Ⅳ级患者,7例为I~Ⅱ级患者。12例良性脑肿瘤和3例正常脑组织RECK表达相对定量值均>0.50。 3.RECK、MMP-2及MMP-9mRNA水平表达情况及相关关系:各病理级别的脑胶质瘤、良性脑肿瘤及正常脑组织的3种基因表达水平经量化后可知RECK表达与胶质瘤的恶性度有统计学意义。 4.经免疫组化分析,以试剂盒中所带阳性片为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞中出现明确的棕黄色颗粒者定为RECK表达阳性,不着色或着色浅而不特异者为RECK表达阴性。RECK蛋白主要定位于细胞质。 5.RECK蛋白表达与脑肿瘤的相关关系:在70例脑肿瘤组织中,胶质瘤组织切片仅有五例为阳性表达,且表达主要在细胞质中,其余65例均无明确的表达。而12例良性肿瘤和正常脑组织则均为阳性表达。 RECK(逆转诱导的富含半胱氨酸,含有kazal 域的蛋白)基因通过cD-NA表达克隆的方法从v-ki-ras转化的NIH3T3细胞系中表达诱导扁平形态的基因分离出来。RECK基因编码大约110KDa的跨膜蛋白,有多个表皮生长因子样的重复区和丝氨酸蛋白酶抑制物相似域。RECK基因普遍存在于各种正常组织和非肿瘤细胞系中,而在一些肿瘤来源的细胞系和肿瘤基因转化的成纤维细胞中,其表达被抑制。当恢复RECK基因表达则抑制了一些肿瘤细胞系的转移或恶性表型,同时抑制这些细胞分泌基质金属蛋白酶MMP-9、MMP-2。 很多研究致力于人类肿瘤转移和恶性表型的分子机理。一些分子,包 括粘附分子、金属蛋白酶和血管源性因子被认为是在转移和恶性型的关系因素。胶质瘤,占颅脑肿瘤的40-50%,是最常见的颅内恶性肿瘤。其预后极差。因此需要找到这个疾病有效的预后指标。本研究中我们探讨了恶性抑制基因RECK作为胶质瘤预后指标的潜在价值,以及相关的金属蛋白酶MMP-9、MMP-2在脑胶质瘤中的变化与RECK的相关关系。目前体内和体外的研究证明胶质瘤的侵袭性与金属蛋白酶MMPs的表达和活化有密切的关系。RECK是近年来发现的一个抑制一些肿瘤细胞系的转移或恶性表型的重要基因,其作用主要是通过抑制金属蛋白酶MMP--9和MMP-2实现的。 我们发现RECK在脑胶质瘤中有一定程度的表达,与之后的肝细胞癌、大肠癌和的临床研究结果一致。RECK高表达可能某种程度上与纤维损伤形成相关,因为RECK蛋白抑制基质降解酶。RECK表达受细胞外激活控制,受Ras信号传导通路抑制,并已知转换很多生长因子信号,同时被一个或多个尚不知的血清因子激活。这样,肿瘤本身可能通过产生这样的可溶性因子影响周围组织RECK表达。同时我们发现RECK表达与脑肿瘤的恶性度有着密切的关系。这一结果与先前实验在肿瘤细胞系中恢复RECK基因表达可使其侵袭及恶性度降低的结果吻合。这就说明RECK表达在抑制脑胶质瘤的恶性进程中起到很重要的作用,即延长患者的生存时间。 虽然RECK抑制肿瘤侵袭的详细机理目前还在研究中,但在RECK表达细胞中抑制金属蛋白酶的分泌直接参与了这一过程是肯定的。但在我们的研究中RECK与MMP-9的表达相似,MMP-2的表达在胶质瘤中也仅有轻微的上升。有研究指出RECK基因启动子区域的SP1结合部位对于该基因表达非常重要。有趣的是,另有一些研究证实SP1是MMP-9基因表达转录上调的必要元素之一。因此,SP1转录因子家族的存在可能是造成RECK和MMP-9 mRNA表达相似的原因。RECK缺失会导致小鼠胚胎死亡,而缺少TIMP1或TIMP2对生长发育的影响力不大。这就说明在胚胎发育过程RECK比TIMPs更具影响力。在将来的研究中,探讨这两组MMPs调节物在肿瘤生长过程中的功能关系是很有意义的。 总之,我们发现RECK在脑肿瘤组织中表达与患者生存时间之间有显著的相关性。RECK在抑制脑胶质瘤的恶性过程中起到重要的作用。RECK表达可以作为脑胶质瘤患者预后的准确标记物。基于RECK及其活性机制的治疗策略将在该病的治疗上很有意义。
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