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TopBP1蛋白在细胞DNA损伤中的作用机制
中文名称: TopBP1蛋白在细胞DNA损伤中的作用机制
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论文编号: 3121581收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: TopBP1 Play a Key Role in Cell Signaling with DNA Damage
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 内科学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 细胞周期检测点 拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1) Claspin 检测点激酶蛋白1(Chk1) 共济失调及毛细血管扩张症突变蛋白(ATM) ATM与Rad3相关蛋白(ATR) BRCA1 C端(BRCT)
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论文简介:为了保证细胞损伤后基因组的完整性,细胞通常会启动检测点机制以阻止细胞周期的进展。其中两个PIKK激酶(phosphinositide 3-kinase-like kinase,磷酸肌醇3激酶样激酶)起着中心的作用:ATM(ataxia telan-giectasia mutated,共济失调及毛细血管扩张症突变蛋白)与ATR(ATMand Rad3 related,ATM与Rad3相关蛋白)。ATM被认为负责放射损伤导致的检查点阻滞的激酶,而ATR则被认为负责复制受阻所致的基因组损伤。二者之间有互补性及简并的功能。在ATR信号传导途径,ATR会激活并使许多下游的底物磷酸化,其中最主要的是Chkl激酶(Cheekpointkinase protein 1,检测点激酶蛋白1)。Chkl一旦被激活会进一步作用于下游底物,其中主要为Cde25A。而Cdc25A会进一步调控Cdk与Cyelin复合物。迄今为止ATR-Chkl信号传导途径已是被公认的应答途径。 检查点蛋白通常被分类成如下几类:探测蛋白,介导蛋白,近端信号传导激酶,远端信号传导激酶,效应蛋白。其中介导蛋白被认为提供场所或者在上游激酶或下游激酶进行信号传递的一组蛋白。由于对损伤应答的不同,ATM与ATR的介导蛋白不同,其中Mdcl,53BPl(p53 binding pro-tein 1,p53结合蛋白1)与BRCAl主要联系于ATM,而Claspin(目前无对应中文翻译)与TopBPl(TopoisomeraseⅡβ binding protein 1,拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1)则被认为是ATR信号传导途径的介导蛋白。 TopBPl.是含有8个BRCT功能域(BRCAl C-terminus,BRCAl C端)1522个氨基酸的蛋白。首先被认为是DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白,在裂殖酵母及芽殖酵母中分别对应为Rad4与Cut5,在细胞受到辐射后形成IRIF(Ionizing radiation induced loci,放射损伤导致的损伤灶),此功能也依赖于其第5个BRCT、功能域。此外,除了DNA损伤时信号的传导,TopBPl还有其他的功能,是DNA复制启动所必需的及当复制受阻时维持复制叉的完整性,DNA的修复,可以抑制E2F1.介导的凋亡及调节正常的S期细胞周期等等。 Claspin是Chkl的结合蛋白。在人类及非洲爪蟾的基因序列非常保守,当细胞受到外界损伤后而这两种蛋白质形成一个稳定的复合物。在酵母这个复合物的形成依赖于人类ATR的类似物Mecl,进一步详尽的研究表明,Claspin直接结合在Chkl的激酶区。Claspin也同样地与ATR直接结合,这样就形成了一个模型:Claspin将Chkl集中到ATR周围,而已经磷酸化的Chkl则会扩散到整个细胞核,发挥其功能作用。 然而到目前为止,TopBPl与Claspin如何同时作用于Chkl的磷酸化,以致于导致其激活,及这两种蛋白对ATR其他底物的作用,尚不清楚。本研究的目的是试图研究这两种蛋白在细胞受到损伤的作用是如何调节Chkl的活性的。同时通过克隆不同的TopBPl变异蛋白,试图研究TopBPI的BRCT功能域,及TopBPl蛋白在癌症发生中的作用。 材料与方法 1.质粒与克隆 ⒈PCNA-Venus:PCR扩增编码YFP-Venus的eDNA(由iapa-ner提供)然后将其克隆至pEGFP-C1(Clontech)中,并替代EGFP。然后再PCR扩增编码PCNA的cDNA,将其按框架插入YFP-Venus之后。 ⒉FLAG-tagged Chkl野生型及激酶灭活型,双突变(serine317and 345被突变成alanine)(Chkl-2A)被克隆至pCI-Neo(由Sorensen提供)。 ⒊shRNA-TopBPl-pSUPERIOR及shRNA-Claspin-pSUPE-RIOR:将分别针对TopBPI及Claspin的oligoes克隆至pSUPERIOR(OligoEngine)的BgllI/HindlII位点。针对TopBPl的oligo为(5’-CCTGAAGAAACCTATTTTG-3’),针对Claspin的oligo(5’-GCAATGAAACTCCGAAGGT-3’)。 2.抗体与siRNAs 兔多克隆抗体P-Chkl$317,P-Chkl$345,P-Nbsl$343,P-Smcl S966(从Cell Signaling购买),TopBPI(Abcam),Claspin(Bethyland Abcam),Chkl(Santa Cruz)and 53BPl(Santa Cruz),山羊多克隆抗体Mcm6(Santa Cruz).鼠单克隆抗体γ-H2AX(Upstate),FLAG(clone M2,Sigma),Chkl(DCS-316),Cdk7(MO-7),Mcm7(DCS- 141)and the p32 subunit of RPA(Neomarkers)and大鼠单克隆抗体Br—dU(OBT0030CX—Immunologicals Direct)。 siRNA对TopBPl为AGACCUUAAUGUAUCAGUAdTdT siRNA对Claspin为GCACAUACAUGAUAAAGAA均从(Drama—con购买) 对照siRNA为针对HSP70B的序列,在U2OS细胞中这种基因缺失。 3.细胞培养与损伤处理 1)人成骨肉瘤U20S细胞(Danish Cancer Society)在含有10%小牛血清及青链霉素的Dulbeccos Modified Eagle Medium(DMEM,Invitro—gen)培养。对于活细胞成像,细胞用不含C0<,2>的培养液(Invitrogen)并且用Lab--Tek microscope glass chambers(Nalge Nunc International)。 2)siRNAs的转染用oligofectamin(Invitrogen),质粒的稳定及短暂转染用FuGene 6(Roche Diagnostics GmbH),操作方法按照使用手册。 A)Claspin及TopBPl inducible shRNA稳定细胞系的建立:将shR—NA—TopBPl一pSUPERIOR或shRNA—Claspin—pSUPERIOR与PCDNA6 T/O(含有Tet--repressor)同时转染到U20S细胞中,24小时后用puromycin(Sigma—lμg/ml)与blasticidin(InvivoGen一5μg/ml)筛选。两周后挑选单个克隆,扩增后,免疫印迹法验证。用终浓度为2μg/ml doxycyclin(BD Biosciences)诱导shRNA的表达。 B)稳定表达GFP--ATR的U20S细胞系(Jazayeri提供)。 C)细胞的放射损伤用X—Ray generator(Pantak HF160,150kV。15mA dose rate 2.18 Gy/min)。UV损伤用Stratalinker 1800(Strata—gene)。 D)Hu(Sigma)加人使终浓度为2mM。 E)激光微照射(Laser micro--irradiation):先将细胞培养于含有10μM BrdU 24小时,然后至于不含CO<,2>的培养液中,用337 nm UV—A laser照射大约200个细胞。 4.免疫化学技术 细胞用含有20 mM Tris,150mM NaCl,1mM EDTA与0.5%NP--40并加入抑制剂的溶液裂解。 免疫沉淀法,首先将1—1.5mg裂解物用40μ150%的Gsepharoseslurry预先混合30分钟,然后加入2ug的FLAG单克隆抗体,混合-小 时;再离心去上清,用IP缓冲液洗4遍,用免疫印迹法分析免疫沉淀物。对于Chkl的印迹,我们用HRP—coupled Protein A来代替常规的第二抗体,以去除Chkl与IgG的重链区重叠的影响。 免疫荧光,将细胞培养在玻片上(Menzel),用4%paraformaldehyde室温下固定15分钟,然后用0.2%Triton X-100渗透化5分钟。用指定的第一抗体染色-小时,用coupled tO Alexa dyes with excitation wave-lengths of 488,568或647 nm的第二抗体染色30分钟(MolecularProbes).在有特殊标记的部位用ToPrO3(Molecular Probes)复染,其他的用DAPI-containing mounting medium复染(Vectashield).图像的取得用带有PLAN-Neofluar 40x/1.3 oil immersion 04ective(Carl Zeiss)的LSM510共聚焦扫描显微镜(Carl Zeiss)。 免疫印迹:取对数期生长的细胞用含有酶抑制剂的IP缓冲液裂解,Bradford方法进行蛋白定量,之后与4*LSB缓冲液混合后100℃加热5分钟,加样于6%-15%SDS-PAGE 100V电泳2小时,半干式转印2小时。然后先后孵育第一抗体及第二抗体(结合辣根过氧化物酶的马抗鼠或兔IgG,Vector laboratories),之后ECL显色(SuperSignalWest Pico(Dura,Femto)Luminol Enhancer Solution与SuperSignalWest Pico(Dura,Fem—to)Stable Peroxide Solution,PIERCE)与曝光。 5.流式细胞术 对指定时间的细胞消化后用70%甲醇固定,之后用0.25%Triton X-100渗透化,之后用含有RNA酶的PI(0.1 mg/ml in PBS)37度染色10分钟,用FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)的CellQuestsoftware分析结果。 1.⒈RNA干扰使蛋白下调的模型的建立。我们成功地克隆了分别诱导下调TopBPl与Claspin的细胞系,经过免疫印迹检测TopBPlClaspin的下调分别在Doxycyclin诱导后72小时及24小时达到最低点。而且通过流式细胞术的分析,在这两个时间点上,两种蛋白的下调并不干扰细胞周期的变化(图1A及图S1)。 ⒉TopBPl或Claspin的下调使DNA损伤导致的Chkl激酶的磷酸 化显著受阻。给予这两种细胞系予以UV-C(254nm,10J/m<'2>),照射损伤。因为UV-C使ATR-Chkl信号途径激活。在两个细胞系中,当两种蛋白质下调后,我们均观察到了Chkl磷酸化信号的强烈衰减,而且我们观察到TopBPl的下调导致更加明显的效果(图1B,C)。 ⒊TopBPl与Claspin对DNA损伤导致的ATR介导的下游底物磷酸化的影响。在UV与Hu导致的DNA损伤中,在TopBPl下调的细胞,所有的ATR底物磷酸化均受阻,而在Claspin下调的细胞,仅Chkl磷酸化受阻(图2A)。另外,在IR介导的DNA损伤中,在两种蛋白分别下调的细胞中,仅Chkl的磷酸化受阻。进一步在进行两种蛋白双重下调的实验中,Chkl的磷酸化下调水平并不是随着Claspin的下调而进一步下降(图2B及图S2)。 ⒋TopBPl与Claspin的空间分布特点。在DNA损伤后,TopBPl与ATR紧密地在损伤处形成小的foci(图3B);而Claspin则是同Chkl类似,迅速地扩展到全细胞核,并不在损伤处聚集(图3A)。又及TopBPl的下调对ATR在损伤处的聚集无影响(图3D)。 ⒌Claspin而不是TopBPl的下调导致了与Chkl受抑类似的表现型,即在Claspin下调后,H2AX的磷酸化在S期细胞升高,而在TopBPI的下调的细胞则无类似的发现(图4A,B)。 ⒍TopBPl而不是Claspin是对复制受阻导致的H2AX磷酸化的主要因素。给予下调TopBPl的细胞UV照射,并用免疫印迹法研究磷酸化的H2AX的表达。与对照细胞相比,H2AX的磷酸化在TopBPl下调的细胞显著受阻(图5A)。 ⒎在DNA损伤Claspin与Chkl的结合依赖于TopBPl。首先通过短暂转染Flag标记的Chkl到U2OS细胞中,证实了Claspin与Chkl仅仅在UV损伤后结合,在给予ATR的抑制剂咖啡因后,特别地抑制了这种结合(图6A)。另外,我们还发现,两个重要的Chkl磷酸化位点s317与s345对二者之间的结合并无影响。在几次实验中,均发现了激酶灭活型的Chkl在与Claspin结合的有不同程度的减低。或者在给予UCN-O1的处理后也有类似的发现(图6B)。为了证实这是否依赖于TopBPl,给予诱导下调TopBPl的细胞转染以Flag-Chkl,转染24小时后给予UV 25J/m<'2>。免疫印迹结果显示在TopBPl下调的细胞中Claspin与Chkl的结合显著降低(图6C)。这些结果表明,TopBPl不仅直接作用于Chkl的s317与s345 的磷酸化,也对Claspin与Chkl的结合起着重要的作用。 2.克隆了两个新的质粒:AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-insensi-tive)及AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-insensitive and R309C)。 3.克隆了FLAG,标记的含有完整TopBPl cDNA及包含不同BRCT、功能域的TopBPl片段及上述质粒的W1145R,DDll46⒎AA,EEll52 ⒊AA的突变序列。 检测点是维持基因组完整性非常重要的机制之一,ATR—Chkl信号传导通路在细胞受到UV或Hu损伤所致的复制叉受阻所发生的细胞信号活动起着至关重要的作用。 有报告表明,ATR对Chkl的激酶活化需要Claspin的参与,在裂殖酵母中Rad4<'TOpBP1>是Rad3<'ATR>的调控蛋白。根据这些资料,我们提出一些问题,1.在人类细胞中TopBPl是否为ATR的调控蛋白。2.如果TopBPI与Claspin都是激活Chkl所必需的,那么二者之间的关系是如何的。3.Claspin蛋白对ATR的其他底物磷酸化是怎样的?4.TopBPl是否对ATR在损伤处的聚集有影响?我们通过一系列实验逐一验证并试图回答了这些问题,并且首次提出了一个TopBPl与Claspin如何监控ATR—Chkl维持基因组完整性的模型,在这个模型中,TopBPl调节几乎所有的ATR对下游底物的激活,而Claspin则专一性地将ATR与Chkl联系在一起。这个模型与最近发表的TopBPl对ATR介导的Radl与Husl磷酸化是必需的一致。进一步地证实了TopBPl作用于Claspin介导Chkl磷酸化的上游。因为我们还发现Chkl磷酸化受阻在TopBPl下调的细胞较Claspin下调的细胞更加明显。另外在TopBPl下调细胞中Chkl的活性受抑已达到最大化,而且进一步下调Claspin对其已不再起作用。更进一步证实了TopBPl对损伤后形成的Claspin-Chkl复合物是必需的。Dunphy等人在刚刚发表的报告中指出了在体外与体内TopBPl均与ATR相结合以及TopBPl是ATR的全激动剂。我们的报告也支持了这个结论。 Chkl与ATR的其他底物显著不同,这是由于Chkl激酶有着极为重要的功能,Chkl的敲除会导至胚胎死亡,Chkl的下调或其激酶活性受到 抑制会使细胞在G2M期阻滞。因此这两种蛋白对Chk1激酶活性的双重调节可以使其生理活性得到更为精确地发挥。 除此之外,我们还第一次证实了Claspin与Chk1一样,在基因组受到损伤后呈现出全细胞核内分布的特点。而TopBP1则和ATR一样,在损伤处聚集。TopBP1的下调对ATR在损伤处的聚集没有影响。结合已发表的资料,我们有如下猜想:RPA与ATRIP负责ATR在损伤处的聚集而TopBP1则负责对ATR的激活,ATR将信号传导至Claspin再到Chk1。然而就这个模型而言还有许多不清楚的地方。例如,RPA是不是TopBP1蛋白在损伤处聚集的决定因素,如果不是,那么是什么蛋白决定TopBP1在损伤处的聚集;我们的结论表明TopBP1可以促进Claspin与Chk1的结合,已知ATR可以同Chk1结合,Claspin与ATR在有无DNA损伤的情况下相结合,并且按照我们的上述结果,ATR与TopBP1呈现相对静止,Claspin与Chk1呈现相对动态的变化,它们在正常的细胞是如何达到一个平衡,在细胞受损时怎样,在损伤得到修复时又会发生怎样的变化。又及这些蛋白都有磷酸化形态,特别是Chkl的s345与s317是非常重要的磷酸化位点,这些蛋白的磷酸化形态与正常蛋白之间是如何达到平衡的。 TopBPl是否是一个抑癌基因也是十分有趣的课题。目前仅有一份未发表的报告,TopBP1的R309C突变在癌症病人中有较高的发生率,又及TopBP1与BRCA1在序列及功能上有很多相似性,而BRCAl是已知的抑癌基因,我们推测TopBP1也具有抑癌基因的特征。因此我们设计了简单的实验检测TopBP1的R309C突变对其功能的影响。 BRCT、家族有很多蛋白质组成,BRCT也是非常重要的功能域,TopBP1作为唯一的仅拥有BRCT功能域的蛋白是研究BRCT功能的很好的对象。我们想知道的是在TopBP1蛋白上,不同的BRCT功能域作用是否相同,以及它们是否协同作用,以及在BRCT功能域之间的连接部分是否也有一定的功能等等。 总之,TopBP1作为ATR的调节蛋白,而TopBP1与Claspin作为不同层面起着调节ATR活性的作用,因此在ATR—Chk1调节通路起着极为重要的作用。其作用机理细节还需要进一步的研究。 结论 1.TopBPl是ATR激酶的全激动剂,而Claspin仅作用于ATR对Chkl的激活。TopBP1对ATR在损伤处的聚集没有影响。这一点与A-TRIP和RPA对ATR的影响是不同的。 2.TopBP1和Claspin对Chk1激酶有着双重调节作用。 3.TopBP1能促进DNA损伤后Claspin与Chkl的结合。 4.TopBP1与ATR是相对静止性的蛋白,而Claspin与Chkl是相对动态性的蛋白,说明了二者对Chkl的不同层面的调节作用。 5.克隆了两个新的质粒:AcGFP-C1-TopBPI(shRNA-insensi-tive)及AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-insensitive and R309C)。 6.克隆了FLAG标记的含有完整TopBPI cDNA及包含不同BRCT功能域的TopBPI片段及上述质粒的W1145R,DDIl46⒎AA,EEll52⒊AA的突变序列。
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