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大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积引起的外周血T细胞应答
中文名称: 大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积引起的外周血T细胞应答
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论文编号: 3121580收藏本论文】【我的收藏】【我要投稿
英文名称: Peripheral T Cells Response to β-Amyloid Peptide Deposition in Rat Brain
学位类型: 博士毕业论文
作者: 涉及隐私,隐去***  作者本人请参看权力声明>>
导师: 涉及隐私,隐去***
毕业学校: 涉及隐私,隐去***
专业: 细胞生物学
毕业年份: 涉及隐私,隐去***
关键字: 阿尔茨海默病 血脑屏障 β淀粉样蛋白 T细胞 MIP-1α CCR5 小胶质细胞 增殖
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论文简介:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是年龄相关的慢性神经系统退行性疾病,严重影响老年人的生活质量。因此,研究AD的发病机制,探索防治AD的干预靶点,是神经科学的工作重点。AD动物模型是研究工作的重要工具。 在对AD发病因素的研究过程中,发现p淀粉样蛋白(beta—amyloidprotein,Aβ)在脑内的沉积是AD发病的早期过程和中心环节。聚集态的Aβ发挥神经毒性,启动了AD的病理进程,包括胶质的广泛活化、炎性微环境产生、神经元功能紊乱及死亡等。 Aβ的沉积活化脑内具有吞噬活性的小胶质细胞,引起先天性免疫应答(innate immune response)。Ap能否募集外周血免疫细胞穿过血脑屏障进入脑向炎症部位聚集,引起过继性免疫应答(adaptive immune response)尚不清楚。血脑屏障由微血管内皮细胞、基底膜和星型胶质细胞的足突构成,将脑实质和血液分开,正常情况下免疫系统的细胞和分子不能自由进入脑。但是,随着研究不断进展,人们逐渐认识到,即使在生理状态下,中枢神经系统内也存在免疫监视过程。外周淋巴细胞可以主动进入脑实质,启动脑内的免疫应答,清除可能会引起脑病变的因子。 。 淋巴细胞穿过血脑屏障是一个复杂的过程。淋巴细胞和微血管内皮细胞表面表达的黏附分子及其受体的相互作用发挥了重要作用。本研究室陈誉华课题组在研究AD病人T细胞穿过血脑屏障机制的过程中,发现AD病人外周血T淋巴细胞穿过血脑屏障体外模型——人脑微血管内皮细胞单层的能力显著增高;并且证实AD病人外周血T淋巴细胞高表达巨嗜细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α);MIP-1α通过调控内皮细胞骨架而引起内皮细胞间的紧密连接开放。基于此,本研究采用立体定向注射的方法,建立Aβ在脑内沉积的动物模型,旨在研究外 周血T细胞所表达的MIP-1a是否为T细胞穿过血脑屏障的决定因子,同时分析人脑的T细胞在AD病变中的可能作用。 1、建立脑内沉积Aβ的动物模型 制备聚集态Aβ<,1-42>和Aβ<,42-1>,通过立体定位技术将Aβ<,1-42>注射到Wist-ar大鼠双侧海马,对照组注射等体积的Aβ<,42-1>和PBS。 2、标本采集与处理 分别于海马注射后3天、7天和14天,从大鼠心脏采血,肝素抗凝。然后经左心室依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛,立即取脑。制备冰冻切片时,脑组织经后固定和蔗糖溶液浸泡,冰冻切片机上行冠状切片,片厚10um,隔lO取l,连续取10张切片。制备石蜡切片时,脑组织经后固定和常规脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤,石蜡切片机上行冠状切片,片厚5um,隔10取1,连续取10张切片。 3、实时定量PCR法检测外周血T细胞中MIP-1仅和CCR5 mRNA的表达水平 构建用于实时定量PCR分析的标准品质粒pUCmT-MIP-1a、pUCmT-CCR5和pUCmT-GAPDH:利用单个核细胞分离液和MagCellect RatCD3<'+>T Cell Isolation试剂盒,分离外周血T细胞。通过Trizol试剂提取T细胞总RNA,并反转录成cDNA。根据MIP-1a、CCR5和GAPDH的基因序列,按定量PCR检测的要求设计引物和Taqman探针。利用PCR技术从T细胞扩增MIP-1a、CCR5和GAPDH基因片段。通过T-A克隆将MIP—la、CCR5和GAPDH基因片段连接到pUCmT载体上,命名为pUCmT-MIP-lA、pUCmT-CCR5和pUCmT-GAPDH。将重组质粒转化感受态细菌DH5a,通过蓝白筛选,酶切鉴定,验证插入片段的存在。将重组质粒送交测序,验证插入片段序列的正确性。 实时定量PCR检测MIP-1a和CCR5:采用相对定量法。以GAPDH作为归一化MIP-1a、CCR5的持家基因。以构建的重组质粒DNA为标准品,以质粒初始模板绝对量的对数作横坐标、Ct值作纵坐标制作标准曲线。以“目的基因初始模板量/GAPDH初始模板量”比值代表每个标本目的基因的mRNA表达水平的相对量。 4、观察Aβ<,1-42>沉积对T细胞穿过血脑屏障的影响 利用Aβ<,1-42>的抗体,通过免疫荧光技术观察Aβ<,1-42>在脑内的沉积。利 用vWF和CCR5的抗体,通过双免疫荧光技术观察Aβ<,1-42>沉积对脑微血管 内皮细胞表达MIP-lα的受体CCR5的影响。利用CD3的抗体,通过免疫 荧光技术观察Aβ<,1-42>沉积对T细胞穿过血脑屏障的影响。利用CD4和 CD8的抗体,通过免疫荧光技术分析穿过血脑屏障的T细胞的亚型。大鼠 腹腔注射MIP-lα的中和抗体,观察阻断MIP-1α的效应对T细胞穿过血 脑屏障的影响。 5、观察干预T细胞人脑对Aβ<,1-42>沉积所引起的小胶质细胞活化和神经 细胞凋亡的影响。 利用CDl1b的抗体,通过免疫组织化学技术观察Aβ活化的小胶质细 胞吞噬沉积的Aβ<,1-42>。利用活化caspase一3的抗体,通过免疫荧光技术观 察海马内注射Aβ<,1-42>后脑内神经细胞凋亡的情况。通过尼氏染色观察 Aβ<,1-42>沉积引起的神经元损伤。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗体,观察 阻断MIP-1α的效应对对小胶质细胞增生、活化和神经细胞凋亡的影响。 6、观察海马内注射Aβ<,1-42>对神经前体细胞增殖和分化的影响 利用Brdu能掺入细胞周期的S期,标记增殖细胞的特性,将Brdu注射 人大鼠腹腔。利用Brdu的抗体,通过免疫组织化学技术观察海马内注射 Aβ<,1-42>对细胞增殖的影响。利用DCX的抗体,通过免疫荧光技术观察海马 内注射Aβ<,1-42>对产生未成熟神经元的影响。利用Brdu和DCX的抗体,通过双免疫荧光技术观察海马内注射Aβ<,1-42>后增殖细胞的表型。 1、成功制备了Aβ在脑内沉积的动物模型。 2、脑内Aβ<,1-42>沉积诱导外周血T细胞过表达MIP-lα,促进T细胞穿过血脑屏障入脑 脑内Aβ<,1-42>沉积引起大量外周血T细胞穿过血脑屏障迁移入脑,与对照组比,数量显著增加(P<0.01),主要分布在大脑皮质和海马,CD4<'+>T细胞和CD8<'+>T细胞都可被观察到。进一步研究发现脑内Aβ<,1-42>沉积诱导外周血T细胞过表达MIP-1α,与对照组比,显著增高(P<0.01);但不上调其受体CCR5在T细胞中的表达(P>0.05)。Aβ<,1-42>沉积还上调了脑微血管内皮细胞膜上CCR5的表达。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗体,阻断MtP-1α的效应后,外周血T细胞进入脑内的数量明显减少,与注射同型IgG的对照组比,差异显著(P<0.01)。 3、阻断T细胞入脑抑制了脑内Aβ<,1-42>沉积引起的小胶质细胞的活化 Aβ<,1-42>沉积引起CDllb阳性小胶质细胞数量显著增加并活化,与对照组比,差异显著(P<0.01),表现为由静止的分枝状转变为活化的阿米巴状;主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子阳性小胶质细胞数量也比对照组显著增加(P<0.01)。并且MHCⅡ类分子阳性小胶质细胞向沉积的AB。一心迁移并加以吞噬。大鼠海马内注射Aβ<,1-42>还引起了神经细胞凋亡数量比对照组显著增多(P<0.01)。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗体阻断T细胞入脑抑制了小胶质细胞增生和活化,但未能抑制神经细胞凋亡。 4、大鼠海马内注射Aβ<,1-42>增强了神经前体细胞增殖和分化能力 Aβ<,1-42>沉积引起海马齿状回颗粒下层(subgranular zone,SGZ)和侧脑室下层(subventricular zone,SVZ)Brdu标记细胞比对照组显著增多(P<0.01)。同时发现SGZ和SVZ区DCX阳性细胞也比对照组显著增多(P<0.01)。双免疫荧光分析发现Brdu标记的增殖细胞多为新生神经元。 1.大鼠脑内Aβ沉积能特异性地诱导外周血T细胞高表达MIP-1α,并上调脑微血管内皮细胞上CCR5的表达。 2.T细胞表达的MIP-1α与脑微血管内皮细胞表面的CCR5的相互作用可能参与到T细胞穿过血脑屏障迁移入脑的过程。 3.进入脑实质的T细胞增强了Aβ沉积所引起的小胶质细胞的活化。 4.大鼠脑内Aβ沉积增强了神经前体细胞的增殖和分化。
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